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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做菌p时空载也能跑出目的条带
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logowang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 木欣欣60 at 2015-01-28 10:06:20
嗯，前辈说的对，1.我现在正把我的载体质粒送去测序，测35s启动子到我需要的酶切位点之间的片段。确保载体无错。2.我之前也用载体的35s启动子和我的目的条带下游引物做的菌p，我以为是自己把两者的退火温度没选好所 ...

挑阳性克隆一般会要求跨插入片段进行扩增检测，这样能看出插入与否并且还可以判断插入方向（单酶切）， 如果单纯的是用目的基因阔增，会出现问题，尤其是转化产物涂板的时候，菌液里含有高量的连接产物dna，很容易会造成平板上挑斑时候的假阳性。需要特别小心。
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11楼2015-01-28 18:56:00
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般是体系污染，或者是你们实验是这段时间经常污染，应该是水或者电泳污染
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12楼2015-01-28 21:24:25
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 18:56:00
挑阳性克隆一般会要求跨插入片段进行扩增检测，这样能看出插入与否并且还可以判断插入方向（单酶切）， 如果单纯的是用目的基因阔增，会出现问题，尤其是转化产物涂板的时候，菌液里含有高量的连接产物dna，很容易 ...

对，我之前就意思到这个问题，但我们实验室一般用目的片段的上下游去菌p，然后出现预期的片段长度就送去测序了。（可能在这一环节就得送很多样品包括假阳性的了），若能测出自己需要的片段，也是个概率问题。
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
13楼2015-01-29 09:48:34
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13227213581

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可能是 你所用菌株的基因组里面 含有你的目的基因  我遇到过这个情况
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justbesunshine
14楼2015-01-31 16:51:46
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