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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关易错PCR
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 有关易错PCR 已有2人参与

各位大神，我对易错PCR的Mg2+、Mn2+浓度进行摸索，条件一样、体系一样，但每次的结果不一样，也不知道原因在哪？有哪位大神遇到过这种情况？知道是什么原因吗？好捉急啊！！！而且用正常条件的PCR还时不时没有条带，还有用于易错PCR的Mn2+是直接购买?还是自己配？
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1楼 2015-01-20 09:54:15
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一砖头飘死

银虫 (小有名气)

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★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 21:09:19
易错PCR话，自己去摸索条件的话比较复杂，我用的是北京天恩泽的易错PCR试剂盒，效果挺好的，可以试试！
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2楼2015-01-20 10:07:53
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-27 11:36:55
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5楼: Originally posted by 水-水 at 2015-03-25 21:38:49
能稳定的扩出来，但每次酶切连接的效率都非常低，几乎没有正确转化子，也是Taq酶的问题吗？...

已经两个月了，呵呵，你不是说PCR时有时无吗，我觉得是聚合酶的问题呀，我们使用的buffer都是本身含有镁离子的，省去了自己对镁离子浓度的优化，扩增较为方面，你现在的没有正确的转化子和酶没有关系，呵呵
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-03-26 08:51:12
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普通回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 21:09:26
如果对镁离子和锰离子的浓度进行摸索，扩增还是有问题，说明这两者是正常的，应该从其他方面考虑原因。
时不时的还没有条带的话，可以考虑一下酶的原因，不知道用的是什么酶呢？易错PCR的话，尽量采用有较低保真度的酶（如热启动Taq酶或者是性能较高的普通Taq酶http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html），不建议使用普通的Taq酶，不一定能扩增出来，且非特异性产物极易产生。
除了对酶、锰离子进行摸索之外，还要改变dNTP的浓度，不能使用KOD Pfu等类似的高保真酶，至于锰离子我认为还是用买的。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-01-20 10:10:23
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 21:09:34
如果对镁离子和锰离子的浓度进行摸索，扩增还是有问题，说明这两者是正常的，应该从其他方面考虑原因。
时不时的还没有条带的话，可以考虑一下酶的原因，不知道用的是什么酶呢？易错PCR的话，尽量采用有较低保真度的酶（如热启动Taq酶或者是性能较高的普通Taq酶http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html），不建议使用普通的Taq酶，不一定能扩增出来，且非特异性产物极易产生。
除了对酶、锰离子进行摸索之外，还要改变dNTP的浓度，不能使用KOD Pfu等类似的高保真酶，至于锰离子我认为还是用买的。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-21 16:58:09
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水-水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-20 10:10:23
如果对镁离子和锰离子的浓度进行摸索，扩增还是有问题，说明这两者是正常的，应该从其他方面考虑原因。
时不时的还没有条带的话，可以考虑一下酶的原因，不知道用的是什么酶呢？易错PCR的话，尽量采用有较低保真度 ...

能稳定的扩出来，但每次酶切连接的效率都非常低，几乎没有正确转化子，也是Taq酶的问题吗？
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5楼2015-03-25 21:38:49
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-26 08:51:12
已经两个月了，呵呵，你不是说PCR时有时无吗，我觉得是聚合酶的问题呀，我们使用的buffer都是本身含有镁离子的，省去了自己对镁离子浓度的优化，扩增较为方面，你现在的没有正确的转化子和酶没有关系，呵呵...

没有正确的转化子怎搞？？？
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7楼2015-03-26 15:43:56
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水-水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-26 08:51:12
已经两个月了，呵呵，你不是说PCR时有时无吗，我觉得是聚合酶的问题呀，我们使用的buffer都是本身含有镁离子的，省去了自己对镁离子浓度的优化，扩增较为方面，你现在的没有正确的转化子和酶没有关系，呵呵...

没有关系吗？这次我连T载体挑取十个菌落，就对了两个！说明扩出来的片段特异性不高。
退一步研究，片段没问题的话，低浓度的DNA量加NEB的酶过夜切，也能切开呀，为啥正确的转化子还是很少，或者几乎没有了！
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8楼2015-03-27 20:21:19
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seraphlx

新虫 (初入文坛)
你好，我想问我在做易错PCR时，加入Mn2+，0.08mM，扩增的结果是有沉淀析出，请问你遇到过么，知道是为什么么？谢啦
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9楼2015-10-08 20:02:05
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by seraphlx at 2015-10-08 20:02:05
你好，我想问我在做易错PCR时，加入Mn2+，0.08mM，扩增的结果是有沉淀析出，请问你遇到过么，知道是为什么么？谢啦

我没有遇到这个问题，怎么会有沉淀析出呢？好奇怪啊，你现在做的顺利吗？容不容易得到阳性克隆？
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10楼2015-12-29 11:27:11
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