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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RACE死活做不出来
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好孩子5521

新虫 (初入文坛)

[求助] RACE死活做不出来已有4人参与

大家好，目前在做RACE，用的invitrogen试剂盒，除了高保真酶用的是pfu的，其余都是按照说明书一步步做的，反转之前测了下RNA质量，5S带有点亮，应该是RNA有些降解，但不至于什么也P不出来吧。巢式PCR也试了，1号基因的3‘端和2号基因的5’端出来了条带，已经检测过5‘是假阳性的。然后又更换了引物，还是没有结果。已经做了3个月了，恳求做过的指点下，很郁闷。
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1楼2015-01-04 16:18:21
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
好孩子5521(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-04 21:18:24
换个聚合酶试试，Pfu保真性好，但是扩增效果不咋的，特别是模板较少的情况下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-01-04 19:59:49
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好孩子5521

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-01-04 19:59:49
换个聚合酶试试，Pfu保真性好，但是扩增效果不咋的，特别是模板较少的情况下。

多谢，下一步就要换换酶试试
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越努力越幸运O(∩_∩)O
3楼2015-01-13 08:32:00
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

预测的条带大约多大？如果0-2kb,可以用platinum Taq 酶试试。3'RACE 要好做些，一般一个PCR 反应就出来了。5'RACE 要求RNA质粒更好一点，你反转录用的是通用引物还是基因特意引物？
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4楼2015-01-13 09:19:41
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erikoyaoyao

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

第一链cDNA的反转录效果怎样？试一下换个引物或者用touch-down PCR看看
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5楼2015-01-20 17:19:08
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liubolin945

铁虫 (小有名气)
你好，请问你race的结果怎么样了？我也在做race。3‘用的是takara的，效果一般，测序结果还不知道

请问5race  你只用过invitrogen的吗？效果怎么样，是官网售价10次10790元吗？
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QQ：277046172
6楼2015-09-18 15:58:50
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naringenin

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

用的最贵的么，那个需要连RNA接头的那个？如果是的话，那么RNA质量决定一切，如果你的RNA有降解，那么依据那个试剂盒的原理，你的5'端根本连不上那个RNA接头，5‘race不会有任何结果！
这个试剂盒还可以。目前本实验室做出来了20个左右基因的5‘race，30多个基因的3’race。

如果不是用的最贵的，用的那个便宜的话，就是接oligodG的，那个确实不好用，比较难做，不过用于做3’race是足够了。

基本就是RNA质量决定一切。

3‘race相对来说好做些，对RNA质量要求低一些。

另如上所述，pfu酶不适合用在这里，推荐takara的LA-taq。
拿到两端后再设计引物用高保真酶做pcr，获得无变异的全长。
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7楼2015-09-18 16:38:06
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