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RACE5‘一直做不出来怎么办？
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小女子最近钓一个基因保守估计在5k以上，3’做出来了，5‘进展很慢，每次都是两轮RACE才会出200-300bp片段。更换过模板，引物也换了不下20对，退火温度设计在65左右，用的66-64-62-60的touchdown程序。就是没有长片段出来。每次巢式后都有很多条带，但都很浅，而且都挨得很近，难以割胶回收，是不是不是特异性的条带啊？如何提高条带特异性，让条带又少又亮？ 另外这次有好几个基因出了700-800条带，连接转化后跑菌液PCR也有700-800bp，为什么测序后比对只有质粒序列呢？ 请各位高手指点迷津。不胜感激。 |
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