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淘气笨笨21

新虫 (初入文坛)

[求助] RACE5‘一直做不出来怎么办？

小女子最近钓一个基因保守估计在5k以上，3’做出来了，5‘进展很慢，每次都是两轮RACE才会出200-300bp片段。更换过模板，引物也换了不下20对，退火温度设计在65左右，用的66-64-62-60的touchdown程序。就是没有长片段出来。每次巢式后都有很多条带，但都很浅，而且都挨得很近，难以割胶回收，是不是不是特异性的条带啊？如何提高条带特异性，让条带又少又亮？
另外这次有好几个基因出了700-800条带，连接转化后跑菌液PCR也有700-800bp，为什么测序后比对只有质粒序列呢？

请各位高手指点迷津。不胜感激。
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1楼 2012-08-14 09:38:27
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
同求，坐等高人。
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2楼2012-08-14 10:30:15
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以加入少量二甲基亚砜做下看，可以提高PCR特异性，对大部分引物有效果，楼主只有试一下看。
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3楼2012-08-14 19:46:48
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
5race本来就难做的，加入少量二甲基亚砜试一试吧，可能有效。我建议楼主更换引物吧。
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4楼2012-08-15 08:46:00
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