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RACE死活做不出来已有4人参与
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大家好，目前在做RACE，用的invitrogen试剂盒，除了高保真酶用的是pfu的，其余都是按照说明书一步步做的，反转之前测了下RNA质量，5S带有点亮，应该是RNA有些降解，但不至于什么也P不出来吧。巢式PCR也试了，1号基因的3‘端和2号基因的5’端出来了条带，已经检测过5‘是假阳性的。然后又更换了引物，还是没有结果。已经做了3个月了，恳求做过的指点下，很郁闷。 : |
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naringenin
新虫 (小有名气)
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- 注册: 2013-03-22
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
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用的最贵的么，那个需要连RNA接头的那个？如果是的话，那么RNA质量决定一切，如果你的RNA有降解，那么依据那个试剂盒的原理，你的5'端根本连不上那个RNA接头，5‘race不会有任何结果！ 这个试剂盒还可以。目前本实验室做出来了20个左右基因的5‘race，30多个基因的3’race。 如果不是用的最贵的，用的那个便宜的话，就是接oligodG的，那个确实不好用，比较难做，不过用于做3’race是足够了。 基本就是RNA质量决定一切。 3‘race相对来说好做些，对RNA质量要求低一些。 另如上所述，pfu酶不适合用在这里，推荐takara的LA-taq。 拿到两端后再设计引物用高保真酶做pcr，获得无变异的全长。 |
7楼2015-09-18 16:38:06