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[求助]
油松蛋白提取 求助！！！！！！！！ 已有1人参与
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最近在提油松蛋白 但效果不理想 恳请高人指点 (1)取-80℃冻存的油松针叶1g研磨成粉末（研磨时按其鲜重的10%加入水不溶性PVPP）； (2)加入3倍体积预冷的蛋白提取液Ⅰ（三氯乙酸10%，巯基乙醇0.07%，丙酮100ml），-20℃沉淀过夜； (3)4℃，10000rpm/min离心30min，弃上清，用3倍于沉淀体积预冷的蛋白提取液Ⅱ（巯基乙醇0.07%，丙酮100ml）将沉淀混匀，-20℃沉淀1h； (4)重复(3)，洗涤沉淀 3-4 次，至蛋白为纯白色，弃去上清； (5)将沉淀冷冻干燥； (6)取0.1-0.2g干粉，加入2mL平衡酚和2mL SDS buffer（30%蔗糖，2%SDS，0.1mol/L Tris-Cl pH8.0，5%β-巯基乙醇）； (7)彻底涡旋，4℃，10000rpm/min离心3min，酚相被分开； (8)上层的酚相吸出，在酚相中加入至少5倍体积0.1mol/L冷醋酸铵甲醇溶液，-20℃沉降30 min； (9)4℃，10000rpm/min离心5min，再用冷醋酸铵甲醇洗沉淀两次，80%丙酮洗两次，沉淀冷冻干燥。 (10)将蛋白干粉加入裂解液，涡旋混匀，26°c水浴1h，离心，取上清。 提出的蛋白量很少 而且最后用裂解液溶液时 蛋白不易溶 不知是哪里有问题 望哪位大侠不吝赐教啊 ！！！万分感谢！！！ |
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