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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位大神：real time PCR曲线求解
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chuiwen

银虫 (著名写手)

[求助] 各位大神：real time PCR曲线求解 已有4人参与

各位大神好，小生最近做一个基因的Real-TimePCR，退火温度为52度和56度均试一次，56度明显不行。52度相对还凑合，但是曲线结果比较调皮：扩增曲线平台期升高之后往下降，熔解曲线目的基因峰值过低，求问诸位大侠这种情况肿么破？（三步PCR,退火温度52度30s）
怎么能让52度时的平台更稳，熔解曲线峰值更高呢？
多谢多谢，感激涕零！
初次尝试，结果不好看，诸位见笑啦

各位大神：real time PCR曲线求解
52度扩增曲线.jpg


各位大神：real time PCR曲线求解-1
52度熔解曲线.jpg


各位大神：real time PCR曲线求解-2
56度扩增曲线.jpg


各位大神：real time PCR曲线求解-3
56度熔解曲线.jpg
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1楼 2014-12-06 21:45:29
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纯正天然

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chuiwen: 金币+10, ★有帮助, 谢谢，引物已经设计过了～但是觉得这对引物还是有可能改善的 2014-12-07 21:18:44
还是重新设计特异性引物吧！基本没什么产物产生啊！
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2楼2014-12-07 20:10:21
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chuiwen: 金币+2, ★有帮助 2014-12-08 09:54:15
chuiwen: 金币+10, ★★★很有帮助, 确实是引物太差劲～刚想起来还在这里问问题了，谢谢 2014-12-19 17:48:52
引物不合适，重新设计吧
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3楼2014-12-08 08:38:40
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ouzhiying

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chuiwen: 金币+2 2014-12-08 09:58:26
相对而言，56度可以，平台期较稳定，CT值24-27，但没看到你的阴性对照
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4楼2014-12-08 08:59:26
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chuiwen

银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ouzhiying at 2014-12-08 08:59:26
相对而言，56度可以，平台期较稳定，CT值24-27，但没看到你的阴性对照

都有阴性对照的，前两张图没出结果的是阴性对照～后两张图阴性对照的峰也是群魔乱舞，区分不开～

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5楼2014-12-08 09:56:25
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chuiwen: 金币+2, ★有帮助 2014-12-08 10:00:25
chuiwen: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-12-19 17:49:43
引物特异性不够吧，峰值不单一啊
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6楼2014-12-08 09:56:48
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chuiwen

银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ouzhiying at 2014-12-08 08:59:26
相对而言，56度可以，平台期较稳定，CT值24-27，但没看到你的阴性对照

56度时， 熔解曲线的峰在低温下出现了一大坨，各种东西～这也可以吗？

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...
7楼2014-12-08 09:58:02
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chuiwen

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 刘芬玲 at 2014-12-08 09:56:48
引物特异性不够吧，峰值不单一啊

我觉得 52度时的Tm峰还可以接受，但是太矮～当然也有可能是求成功心切产生的错觉，哈哈

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8楼2014-12-08 10:00:10
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