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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 其它 » 关于高效液相色谱HPLC 梯度洗脱的问题
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海浪016

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于高效液相色谱HPLC 梯度洗脱的问题 已有4人参与

我有个样品是用HPLC梯度洗脱 来进行液相分析，但是配出来的流动相在洗脱过程中的主峰出峰时间总是变化，比如说配了一瓶流动相 出峰时间为35min，再配一瓶流动相打样的时候主峰出峰时间可能就变成了25min或45min。请教一下各位虫友，这可能是什么原因？
说明一下：1、我配制的流动相A为磷酸二氢铵缓冲液，PH用磷酸调节为3.1，该缓冲液过滤后经过超声后使用。梯度洗脱的流动相B为色谱乙腈。
                  2、在整个过程中其他条件都相同，比如所用仪器相同、柱温相同、色谱柱相同，进样量、标准品相同、检测波长相同。
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1楼 2014-11-25 21:18:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gwmgyp

版主 (知名作家)

搬砖将

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
海浪016: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-11-26 08:59:59
出现这么大的偏差,直觉不是方法的事儿,对比一下色谱柱是否出现问题,还有仪器状态是否良好,多半是仪器系统出了问题,观察一下系统压力有没有波动很大.
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gwmgyp
3楼2014-11-26 08:14:32
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普通回帖

yuecen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
海浪016: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-11-26 08:59:43
您的流动相是偏酸性的，样品出峰在25-45min之间，说明样品在这个PH条件下比较敏感，或者说是正好在它的敏感点上，建议查查样品的PKA或PKB的值，使流动相的PH值跳出样品的敏感范围就好了。我猜您的样品是有些偏酸性的，所以估计PH增加2-3个就好了，但那样可能会造成样品出峰靠前，如果您是做有关物质不能满足要求的话，就只好考虑换个流动相啦
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2楼2014-11-25 23:30:55
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海浪016

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gwmgyp at 2014-11-26 08:14:32
出现这么大的偏差,直觉不是方法的事儿,对比一下色谱柱是否出现问题,还有仪器状态是否良好,多半是仪器系统出了问题,观察一下系统压力有没有波动很大.

压力、仪器都是正常的。就是换一瓶流动相后出峰时间就有可能变化了。一开始我认为是流动相的PH有问题，但测定后PH基本相同，再说对于一种成品的标准检验方法来说，流动相PH的略微变化应该对主峰的出峰时间影响很小。
后来发现分析中心一分析员配出来的流动相总是在40-45分钟左右，而我重新按方法配出来的一般在30分钟左右，所以我想是不是在溶解缓冲盐的过程中是不是没有溶解完全。请问一下，在流动相配置的过程中缓冲盐的浓度对出峰时间的影响？
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4楼2014-11-26 08:51:03
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torekill

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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海浪016: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-11-26 09:01:04
如果仪器没有问题的话，怀疑是流动相的问题
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5楼2014-11-26 08:51:34
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海浪016

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuecen at 2014-11-25 23:30:55
您的流动相是偏酸性的，样品出峰在25-45min之间，说明样品在这个PH条件下比较敏感，或者说是正好在它的敏感点上，建议查查样品的PKA或PKB的值，使流动相的PH值跳出样品的敏感范围就好了。我猜您的样品是有些偏酸性的 ...

我的样品是酸性的，等电点是在3.5-4.0。这个方法是我们这里成品的标准检验方法。我想是不是流动相中缓冲盐没有溶解完全导致的？
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6楼2014-11-26 08:56:32
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海浪016

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by torekill at 2014-11-26 08:51:34
如果仪器没有问题的话，怀疑是流动相的问题

那流动相有问题的话，是缓冲盐的影响还是PH的影响？哪个影响大？怎么影响？
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7楼2014-11-26 08:58:54
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yuecen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 海浪016 at 2014-11-26 08:56:32
我的样品是酸性的，等电点是在3.5-4.0。这个方法是我们这里成品的标准检验方法。我想是不是流动相中缓冲盐没有溶解完全导致的？...

应该不是由于缓冲盐没有溶解所致，按说PH3.1也还好啊。如果是现成的检验标准的话，那么分析员配的流动相应该是比您配的流动相PH偏低一点点，由固定的人员来配置流动相A好了。我个人认为也许是缓冲盐称量多了一点点，也许是调PH值的习惯不同造成的，总之应该是人为误差，每个人的实验习惯不同，与其纠结在此，不如由一个人来完成流动相的配置尽早完成实验的好。
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8楼2014-11-26 09:27:13
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赈早见琥珀主

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一瓶水相一瓶有机相，可能会造成混合不均匀甚至盐析出的情况，导致保留时间变化，尝试在A相中预先加一点有机相比如5%乙腈看看，当然，梯度条件也要因此而微调一下
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铁甲依然在
9楼2014-11-26 12:15:15
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holmessakura

木虫 (小有名气)
个人觉得缓冲液是否存在变化，其他还可能是柱子的原因。
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10楼2014-11-26 17:15:29
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