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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定点突变测序结果居然没有突变上，什么原因
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1360548549

金虫 (初入文坛)

[交流] 定点突变测序结果居然没有突变上，什么原因 已有5人参与

我正在做定点突变，利用导师设计好的定点突变引物扩增后，dpn1酶解去除未点突变的模板，然后进行T载体连接转化（有设对照，对照未长），送去测序后，居然没有测到点突变，这是什么原因呢？
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1楼 2014-11-23 20:28:56
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yingxiaoying

新虫 (初入文坛)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-24 12:33:43
换扩增酶试试 高保真的可能在pcr时就自动修复了
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2楼2014-11-24 09:49:22
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xiaoyugutou

捐助贵宾 (小有名气)
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if your mutant is on primer, I guess its the problem of primer
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4楼2014-11-26 05:58:43
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普通回帖

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
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定点突变用t载体？
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2014-11-26 05:20:55
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1360548549

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingxiaoying at 2014-11-24 09:49:22
换扩增酶试试 高保真的可能在pcr时就自动修复了

也有这个可能，我用的是takara公司的ex hs 酶，您一般用什么酶呢
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5楼2014-11-26 20:27:07
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1360548549

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-11-26 05:20:55
定点突变用t载体？

之前用的是mbp载体，连接T载体是测序用的；我是从重组的mbp载体上扩增目的片段，然后连接到T载体，送去测序，看我的目的片段有没有正确点突变，这个方法可行吗，您一般都怎么做呢
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6楼2014-11-26 20:29:11
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1360548549

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaoyugutou at 2014-11-26 05:58:43
if your mutant is on primer, I guess its the problem of primer

对哦，这个也有可能，但是我引物设计的时候确实是点突变的哇
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7楼2014-11-26 20:29:52
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)
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KOD plus 试试，另外适当提高点退火温度，57-60，试试

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学海无涯懂做舟
8楼2014-11-26 23:04:35
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 1360548549 at 2014-11-26 00:29:11
之前用的是mbp载体，连接T载体是测序用的；我是从重组的mbp载体上扩增目的片段，然后连接到T载体，送去测序，看我的目的片段有没有正确点突变，这个方法可行吗，您一般都怎么做呢...

哦，我只是觉得直接可以用mbp载体测序，t载体比测序引物贵多了
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
9楼2014-11-26 23:27:48
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:03:54
引物没有问题的话应该就是模板的问题，建议模板少加一点！模板消化后不是直接纯化做transformation吗，怎么还要连到T载上！
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10楼2014-11-26 23:42:01
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