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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变蛋白质不表达
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xdfy0301

新虫 (初入文坛)

[求助] 定点突变蛋白质不表达已有1人参与

近期，做了几个点的定点突变，突变点是通过软件模拟得到的。通过突变，转化发酵，结果突变体没有酶活。突变体DNA测序表明突变正确，没有移码。但未能找到不表达的原因，向各位求助，指点一下何种原因导致不表达，谢谢。
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1楼2013-11-22 20:15:01
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-23 01:23:52
xdfy0301: 金币+2 2013-11-24 20:09:55
定点突变蛋白质不表达和结果突变体没有酶活不是一回事吧，你的蛋白是否表达呢，做个western看看
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2楼2013-11-22 20:40:22
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xdfy0301

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 20:40:22
定点突变蛋白质不表达和结果突变体没有酶活不是一回事吧，你的蛋白是否表达呢，做个western看看

跑过SDS变性电泳，没有目的条带（正常目的条带很粗）因此，推测为没有表达
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3楼2013-11-23 16:31:26
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南子枫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xdfy0301: 金币+1 2013-11-24 20:10:03
难道是你突变的位点对表达有重要作用？
RT-PCR看看有没有转录活性如何？
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4楼2013-11-23 19:31:00
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主！我和你遇到是同样的问题！我推测应该是没有表达！
理由如下：
我用pET28a连接了一个目的基因（野生型），然后去做蛋白表达，SDSPAGE显示表达强度很高（条带很明显）。
然后我自己设计引物做了一轮定点突变，测序结果正确，同样去做蛋白表达，但是SDSPAGE就没有对照条带。
我推测的结果是没有表达，但是没有表达的原因说不清楚，感觉特别奇怪。
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5楼2013-12-05 20:14:03
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有一种可能，就是这种突变酶（突变蛋白）可能严重的改变了空间结构，导致结构不稳定，在表达的时候被快速降解了（就是半衰期可能特别短）。
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6楼2013-12-05 20:19:14
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xdfy0301

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 南子枫 at 2013-11-23 19:31:00
难道是你突变的位点对表达有重要作用？
RT-PCR看看有没有转录活性如何？

请问 有什么软件可以分析这个位点的mRNA吗
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7楼2013-12-06 11:02:42
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xdfy0301

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by w_goodluck at 2013-12-05 20:14:03
楼主！我和你遇到是同样的问题！我推测应该是没有表达！
理由如下：
我用pET28a连接了一个目的基因（野生型），然后去做蛋白表达，SDSPAGE显示表达强度很高（条带很明显）。
然后我自己设计引物做了一轮定点突变 ...

你是针对其什么特性做的突变
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8楼2013-12-06 11:05:09
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xdfy0301 at 2013-12-06 11:05:09
你是针对其什么特性做的突变...

是我们之前发现这个基因发生的某个突变导致了菌株成为了营养缺陷型（应该是该酶失活了）。做的就是这个基因突变，没有做过相应的分析。
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9楼2013-12-06 11:52:25
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南子枫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xdfy0301 at 2013-12-06 11:02:42
请问 有什么软件可以分析这个位点的mRNA吗...

为什么分析mRNA？不用吧
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10楼2013-12-07 17:28:28
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