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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 双抗夹心ELISA方法的建立
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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)

[求助] 双抗夹心ELISA方法的建立 已有6人参与

我做双抗夹心ELISA时遇到下面的情况，求高手指教“一抗+5%的脱脂奶粉封闭+阴阳血清及空白对照+自己标记的HRP二抗+显色+终止“，结果阴性和空白都呈阳性，能不能帮忙分析分析是什么原因造成的？？？？？？？？？？
一抗和二抗都是由本实验室自己制备的！
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1楼 2014-11-13 15:33:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

long20081990

新虫 (初入文坛)
空白都显阳性首先确定你这组实验错误。
原因第一：加二抗后洗了没。
      第二：如果洗了，那就说明二抗交联上去了，有可能封闭液过期了，或者封闭液没有封闭上(时间，温度等）。
     第三：很多时候有一些抗体会出现一抗与二抗直接交联的情况（应该很上吧，但我就碰到过一次，实在洛阳百泰科买的）。
     第四：你必须确定你空白是不是加错了。
     第五：显色剂变质了，我最开始做的时候TMB自配就出现过这种问题，它自己都变色了。
如果你的实验操作正确的话，应该是没封闭好吧（或者你的脱脂奶风有问题啊，买点BSA 试试便宜的。其它原因你在做实验的时候很容易就发现了。
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4楼2014-11-18 11:14:21
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sfeqhl

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
电风扇魏哥: 金币+1 2015-05-04 14:51:43
引用回帖:
6楼: Originally posted by 电风扇魏哥 at 2014-11-25 16:16:43
谢谢您的回复，您的意思是  “封闭 + 一抗 + 5%的脱脂奶粉封闭  + 阴阳血清及空白对照 + 自己标记的HRP二抗 + 显色 + 终止”吗？这样的设计我还没有试过。现在我降低了包被一的抗浓度，使用0.2%的吐温-20洗板，可还 ...

还有一种可能就是你的包被的抗体，和你标记的二抗发生了交叉反应

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10楼2014-11-26 08:42:12
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普通回帖

biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-11-25 17:32:20
封闭或非特异性结合······
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年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
2楼2014-11-14 21:01:54
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feiguyuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-11-25 17:32:30
电风扇魏哥: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-05-04 14:53:43
第一，你的阴性血清是从哪里来的？这些东西不能自己随随便便制备，需要从正规科研所购买
第二，你的二抗是是否确实标记上了，是否验证能否显色，可能是你中间的步骤不合理，我们没有看到这个关键的标记步骤不能随便下结论
第三，你的显色液是否用二抗证明有显色，如果没有，可取少量显色液加入少量二抗证明之
第四，你的包被蛋白用的包被液是什么成分，一般情况下是碳酸盐  ，另外是否证明已经包被上了？

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3楼2014-11-15 07:25:59
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sfeqhl

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

为什么不先封闭再加一抗呢？

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5楼2014-11-19 18:10:09
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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sfeqhl at 2014-11-19 18:10:09
为什么不先封闭再加一抗呢？

谢谢您的回复，您的意思是  “封闭 + 一抗 + 5%的脱脂奶粉封闭  + 阴阳血清及空白对照 + 自己标记的HRP二抗 + 显色 + 终止”吗？这样的设计我还没有试过。现在我降低了包被一的抗浓度，使用0.2%的吐温-20洗板，可还是全部显色，很着急，快毕业了，求高手指点
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6楼2014-11-25 16:16:43
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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biotech_zhou at 2014-11-14 21:01:54
封闭或非特异性结合······

谢谢您的回复，非特异性结合的可能性 很大，我又换了一组一抗和二抗，二抗还是自己标记，这两株单抗都是识别不同位点，结果坐下来还是全板显色，求您指教，感激
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7楼2014-11-25 16:21:08
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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by long20081990 at 2014-11-18 11:14:21
空白都显阳性首先确定你这组实验错误。
原因第一：加二抗后洗了没。
      第二：如果洗了，那就说明二抗交联上去了，有可能封闭液过期了，或者封闭液没有封闭上(时间，温度等）。
     第三：很多时候有一些抗体 ...

谢谢您的回复：
第一：加二抗，我洗了，用的是0.2%的吐温-20洗的，我是用本实验室的单抗自己标记的HRP，没有买商品化的二抗
第二：空白加的是PBS
第三“：显色剂颜色没有变，还是很清亮
综上，可能是没封闭好的原因吧，我用的是0.5%的脱脂奶粉封闭2h，37℃，请问您是用什么封闭的呢？
我的试验程序是：”一抗（实验室自己制备的）+5%的脱脂奶粉封闭+阴阳血清及空白对照+自己标记的HRP二抗（实验室自己制备的单抗）+显色+终止“
感谢您
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8楼2014-11-25 16:27:58
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sfeqhl

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
电风扇魏哥: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-05-04 14:51:23
引用回帖:
6楼: Originally posted by 电风扇魏哥 at 2014-11-25 16:16:43
谢谢您的回复，您的意思是  “封闭 + 一抗 + 5%的脱脂奶粉封闭  + 阴阳血清及空白对照 + 自己标记的HRP二抗 + 显色 + 终止”吗？这样的设计我还没有试过。现在我降低了包被一的抗浓度，使用0.2%的吐温-20洗板，可还 ...

不是，是包被后加封闭液封闭，再加一抗，再加二抗。一般都不会是pbst的问题，我们的0.05%的pbst都洗的很干净。或者一抗二抗浓度太高，可以拉个梯度找个最合适的浓度再做

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9楼2014-11-26 08:36:59
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