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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)

[求助] 双抗夹心ELISA方法的建立 已有6人参与

我做双抗夹心ELISA时遇到下面的情况,求高手指教“一抗+5%的脱脂奶粉封闭+阴阳血清及空白对照+自己标记的HRP二抗+显色+终止“,结果阴性和空白都呈阳性,能不能帮忙分析分析是什么原因造成的??????????
一抗和二抗都是由本实验室自己制备的!
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电风扇魏哥

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by long20081990 at 2014-11-18 11:14:21
空白都显阳性首先确定你这组实验错误。
原因第一:加二抗后洗了没。
      第二:如果洗了,那就说明二抗交联上去了,有可能封闭液过期了,或者封闭液没有封闭上(时间,温度等)。
     第三:很多时候有一些抗体 ...

谢谢您的回复:
第一:加二抗,我洗了,用的是0.2%的吐温-20洗的,我是用本实验室的单抗自己标记的HRP,没有买商品化的二抗
第二:空白加的是PBS
第三“:显色剂颜色没有变,还是很清亮
综上,可能是没封闭好的原因吧,我用的是0.5%的脱脂奶粉封闭2h,37℃,请问您是用什么封闭的呢?
我的试验程序是:”一抗(实验室自己制备的)+5%的脱脂奶粉封闭+阴阳血清及空白对照+自己标记的HRP二抗(实验室自己制备的单抗)+显色+终止“
感谢您
8楼2014-11-25 16:27:58
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚:专业/专注/专心

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
youlinglyw: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩! 2014-11-25 17:32:20
封闭或非特异性结合······
年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折!交流锤炼知识,用心构筑桥梁,以更优质的产品及技术服务助力科研;QQ:2513165427;Email:b
2楼2014-11-14 21:01:54
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feiguyuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩! 2014-11-25 17:32:30
电风扇魏哥: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-05-04 14:53:43
第一,你的阴性血清是从哪里来的?这些东西不能自己随随便便制备,需要从正规科研所购买
第二,你的二抗是是否确实标记上了,是否验证能否显色,可能是你中间的步骤不合理,我们没有看到这个关键的标记步骤不能随便下结论
第三,你的显色液是否用二抗证明有显色,如果没有,可取少量显色液加入少量二抗证明之
第四,你的包被蛋白用的包被液是什么成分,一般情况下是碳酸盐  ,另外是否证明已经包被上了?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-11-15 07:25:59
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long20081990

新虫 (初入文坛)

空白都显阳性首先确定你这组实验错误。
原因第一:加二抗后洗了没。
      第二:如果洗了,那就说明二抗交联上去了,有可能封闭液过期了,或者封闭液没有封闭上(时间,温度等)。
     第三:很多时候有一些抗体会出现一抗与二抗直接交联的情况(应该很上吧,但我就碰到过一次,实在洛阳百泰科买的)。
     第四:你必须确定你空白是不是加错了。
     第五:显色剂变质了,我最开始做的时候TMB自配就出现过这种问题,它自己都变色了。
如果你的实验操作正确的话,应该是没封闭好吧(或者你的脱脂奶风有问题啊,买点BSA 试试便宜的。其它原因你在做实验的时候很容易就发现了。
4楼2014-11-18 11:14:21
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