| 查看: 2467 | 回复: 11 | |||
[交流]
镍柱有很多杂蛋白是缓冲液的问题还是什么问题？ 已有6人参与
|
|||
|
可溶性蛋白的纯化 1） 平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。 2） 洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。 3） 取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。 4） 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 5） 用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 6） 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭。 这些是我实验用到的，可以镍柱纯化效果还是不理想，杂蛋白，怎么办？ |
回复此楼» 猜你喜欢
人气不行了
已经有6人回复
-
今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果
已经有18人回复
-
感觉是下周放榜了
已经有12人回复
-
看来今天不会放榜了？
已经有5人回复
-
我面上完蛋了
已经有8人回复
-
只有每年这种时候来逛逛小木虫
已经有25人回复
-
什么时候开奖？
已经有7人回复
-
时间戳又变了
已经有18人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有27人回复
-
今天基金会出结果吗？20260819
已经有16人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化实验求助
已经有8人回复
- 镍柱纯化蛋白，遇到史上最顽固的杂蛋白
已经有23人回复
- 蛋白纯化时用的HFPES缓冲液配制问题
已经有7人回复
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 请问大家过柱子用缓冲液去除杂蛋白一般多长时间？
已经有8人回复
- 镍柱纯化中再生后柱子变白，什么问题？
已经有22人回复
- 蛋白质的Ni柱纯化问题
已经有23人回复
- 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
已经有20人回复
- 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
已经有28人回复
- 关于脱盐柱的问题
已经有35人回复
- 蛋白纯化镍柱、分子筛
已经有9人回复
- 过带his标签的蛋白时镍柱上样后颜色变棕色是怎么回事
已经有17人回复
- 2×蛋白上样缓冲液配方
已经有5人回复
- Tris-Hcl缓冲液
已经有8人回复
- 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
已经有18人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 请问谁用过GE的预装柱（镍柱）
已经有10人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
9楼2014-11-11 16:29:48
wolfman840
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 225 (大学生)
- 金币: 3524.8
- 散金: 20
- 红花: 12
- 帖子: 702
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 902627
- 注册: 2009-11-14
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
你的洗脱缓冲液含咪唑的浓度需要摸索，按你的说法，是直接洗脱了。你可以试试梯度洗脱。方法如下 1.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱。0.5ml/min，收集，1ml/管。 2.load，样品用0.25ml/min流速，上样。最好上样前测一下你的蛋白吸光度，在穿过液中再测一下。如果达到10%上样吸光度，就不要上了。（前提是你有在线监测UV的） 3.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱，0.5ml/min，收集，1ml/管。 4.洗脱，用20ml洗脱buffer以0.5ml/min流速进行线性洗脱。1ml/管收集。检测你的目的蛋白，收集纯度较高的一段。 5.再生。5ml洗脱buffer以0.25ml/min流速清洗柱子后，立即用平衡buffer冲洗20ml。加20%乙醇，封闭。 |
2楼2014-10-08 14:22:56
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2014-10-09 16:30:11
super_mm
木虫 (小有名气)
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 1779.3
- 红花: 2
- 帖子: 111
- 在线: 20.8小时
- 虫号: 3467080
- 注册: 2014-10-11
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
4楼2014-10-11 10:39:54
|
本帖内容被屏蔽 |
5楼2014-10-11 17:50:39
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
6楼2014-10-17 11:27:45
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2014-10-20 10:53:05
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2014-10-28 11:37:29
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
10楼2015-04-21 18:12:11
40