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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 镍柱有很多杂蛋白是缓冲液的问题还是什么问题？
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xiaosheng123

新虫 (初入文坛)

[交流] 镍柱有很多杂蛋白是缓冲液的问题还是什么问题？ 已有6人参与

可溶性蛋白的纯化
1） 平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。
2） 洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。
3） 取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。
4） 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
5） 用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
6） 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭。
这些是我实验用到的，可以镍柱纯化效果还是不理想，杂蛋白，怎么办？
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1楼 2014-10-08 11:50:45
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大柏树

禁言 (小有名气)
★
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6楼2014-10-17 11:27:45
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wolfman840

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的洗脱缓冲液含咪唑的浓度需要摸索，按你的说法，是直接洗脱了。你可以试试梯度洗脱。方法如下
1.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱。0.5ml/min，收集，1ml/管。
2.load，样品用0.25ml/min流速，上样。最好上样前测一下你的蛋白吸光度，在穿过液中再测一下。如果达到10%上样吸光度，就不要上了。（前提是你有在线监测UV的）
3.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱，0.5ml/min，收集，1ml/管。
4.洗脱，用20ml洗脱buffer以0.5ml/min流速进行线性洗脱。1ml/管收集。检测你的目的蛋白，收集纯度较高的一段。
5.再生。5ml洗脱buffer以0.25ml/min流速清洗柱子后，立即用平衡buffer冲洗20ml。加20%乙醇，封闭。
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2楼2014-10-08 14:22:56
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fudan木子

禁言 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
3楼2014-10-09 16:30:11
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super_mm

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的洗脱缓冲液咪唑浓度太高了。一般的带His标签的蛋白100-200左右的浓度就洗下来了，而且比较纯，主要摸索200mM以下的咪唑浓度。一般是20mM递增
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4楼2014-10-11 10:39:54
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