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[交流]
镍柱有很多杂蛋白是缓冲液的问题还是什么问题？ 已有6人参与
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可溶性蛋白的纯化 1） 平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。 2） 洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。 3） 取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。 4） 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 5） 用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 6） 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭。 这些是我实验用到的，可以镍柱纯化效果还是不理想，杂蛋白，怎么办？ |
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5楼2014-10-11 17:50:39
wolfman840
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你的洗脱缓冲液含咪唑的浓度需要摸索，按你的说法，是直接洗脱了。你可以试试梯度洗脱。方法如下 1.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱。0.5ml/min，收集，1ml/管。 2.load，样品用0.25ml/min流速，上样。最好上样前测一下你的蛋白吸光度，在穿过液中再测一下。如果达到10%上样吸光度，就不要上了。（前提是你有在线监测UV的） 3.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱，0.5ml/min，收集，1ml/管。 4.洗脱，用20ml洗脱buffer以0.5ml/min流速进行线性洗脱。1ml/管收集。检测你的目的蛋白，收集纯度较高的一段。 5.再生。5ml洗脱buffer以0.25ml/min流速清洗柱子后，立即用平衡buffer冲洗20ml。加20%乙醇，封闭。 |
2楼2014-10-08 14:22:56
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3楼2014-10-09 16:30:11
super_mm
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4楼2014-10-11 10:39:54
20