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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR 疑难杂症
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忘记将来

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR 疑难杂症 已有2人参与

这几天跑的荧光定量PCR结果很糟糕；请有经验的大侠指点一二：
基因拷贝数偏低，Ct值开始40左右，优化后30-32，但是问题出现了，NTC也有扩增了，换了一管新的引物（干粉稀释）结果还是一样，根据溶解曲线判断应该是产物
在荧光定量前，用普通PCR鉴定过，条带大小和测序结果都对；用荧光定量pcr的结果跑电泳，条带位置跟以前一样（包括NTC）；30左右拷贝数应该也有10的3次方了，难道是产物污染？？？
还有就是荧光信号很低，会是假阳性扩增么？？？？还是因为模板的拷贝数很低造成的？模板加量已经很多，为什么实验组跟NTC的Ct值几乎一样呢？？？？
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1楼 2014-09-25 13:15:10
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
忘记将来: 金币+2, ★有帮助 2014-09-29 10:45:54
NTC也有扩增的话，就可能是引物二聚体，降低一下引物的浓度试试。
当然，此前要确保不是气溶胶污染咯。
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6楼2014-09-28 14:27:33
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-25 21:37:18
忘记将来: 金币+3, 谢谢 2014-09-26 09:10:25
你的阴性对照，或者说水是什么水？是公司买的嘛？还是去离子水灭菌的？
以前也遇到过类似现象，换了水之后就行了，不知道是否符合你的情况
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2楼2014-09-25 13:59:15
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忘记将来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2014-09-25 13:59:15
你的阴性对照，或者说水是什么水？是公司买的嘛？还是去离子水灭菌的？
以前也遇到过类似现象，换了水之后就行了，不知道是否符合你的情况

不是买的，是灭菌的超纯水。
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3楼2014-09-25 15:00:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 忘记将来 at 2014-09-25 15:00:16
不是买的，是灭菌的超纯水。...

是的哈，我就是用的灭菌超纯水原来。。。。
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4楼2014-09-26 08:50:04
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