| 查看: 5594 | 回复: 20 | |||
鬼羽帝魂木虫 (著名写手)
|
[求助]
大片段连接大载体难以连接的问题 已有4人参与
|
||
|
最近做实验，大片段连接大载体。 载体、片段用相同的酶双酶切后回收，再连接。 （1）载体10000、片段4000，（2）载体12700、片段4334，改变体系做了3次。 第一次（1）长了1个，（2）长了好多，但是酶切验证都不对 第二次，第三次都没长单克隆。 连接时载体：片段为1:5，最大试过1:10，16度过夜或者8小时以上。 甚至，我连接酶都加了2ul（10ul的体系） 卡住了我在这，求指导，谢谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有121人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- T载体连接问题
已经有4人回复
- pMD-19T载体与目的片段的连接问题
已经有34人回复
- 目的片段载体片段连接不长菌
已经有19人回复
- 急求！大容量载体与片段连接问题
已经有5人回复
- 目的片段和载体连接一直不上
已经有24人回复
- 平末端加A尾连接T载体的问题
已经有14人回复
- 长片段连接问题
已经有14人回复
- 片段总是连不到T载体上
已经有22人回复
- DNA片段连接到载体上都有什么方法
已经有6人回复
- T载体连接温度和时间
已经有7人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- 长片段连接问题
已经有12人回复
- 目的片段与载体连接后无法检测出
已经有7人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- 载体连接pcr片段一直连不上
已经有17人回复
- 长片段DNA如何连接载体
已经有21人回复
- 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！
已经有17人回复
zhangbighui
金虫 (正式写手)
- 应助: 37 (小学生)
- 金币: 1468.9
- 红花: 4
- 帖子: 322
- 在线: 49.9小时
- 虫号: 2564731
- 注册: 2013-07-25
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-09-04 14:32:05
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:29:06
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-09-04 14:32:05
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:29:06
| 对于大片段连接的确是一个很难的问题，我在这上面也受了很多苦头，先把自己的经验奉上，1，对载体与基因片段进行分析，如GC含量，二级结构，大片段之所以连接不上很有可能是片段大形成螺旋结构降低连接碰撞机率，建议在加入连接酶的同时加入拓朴异构酶（promega有卖），可以提高阳性率;2，可采取分段连接的策略，在载体上寻找一个大小合适单酶切从位点切下，进行三片段连接，我用这个方法连接过几个大片段都好用，不过平端的话得验证连接顺序有点麻烦;3,运用IN-Fusion技术进行无缝连接，但对于大片段PCR扩增时需要高保真酶，由于PCR有一定的错误几率，我一般是先将PCR产物连接克隆载体，测序正确后，在克隆载体上切下来去IN-Fusion连接，效果也不错 |
7楼2014-09-04 10:38:25
2楼2014-09-04 09:13:23
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-09-04 09:15:06
huyan0817
木虫 (正式写手)
- 应助: 55 (初中生)
- 金币: 3604.8
- 红花: 3
- 帖子: 344
- 在线: 119.7小时
- 虫号: 1232425
- 注册: 2011-03-14
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-09-04 09:52:00
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2014-09-04 10:12:14
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
6楼2014-09-04 10:12:56
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
8楼2014-09-04 10:44:11
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
9楼2014-09-04 10:44:19
jurkat.1640
至尊木虫 (文坛精英)
- MolEPI: 1
- 应助: 908 (博后)
- 金币: 17177
- 散金: 1654
- 红花: 121
- 沙发: 41
- 帖子: 14525
- 在线: 2184.9小时
- 虫号: 514340
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
10楼2014-09-04 11:14:04
