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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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[求助] 大片段连接大载体难以连接的问题已有4人参与

最近做实验，大片段连接大载体。
载体、片段用相同的酶双酶切后回收，再连接。
（1）载体10000、片段4000，（2）载体12700、片段4334，改变体系做了3次。
第一次（1）长了1个，（2）长了好多，但是酶切验证都不对
第二次，第三次都没长单克隆。

连接时载体：片段为1:5，最大试过1:10，16度过夜或者8小时以上。
甚至，我连接酶都加了2ul（10ul的体系）

卡住了我在这，求指导，谢谢。

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1楼 2014-09-04 08:56:08

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鬼羽帝魂

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引用回帖:

7楼: Originally posted by zhangbighui at 2014-09-04 10:38:25
对于大片段连接的确是一个很难的问题，我在这上面也受了很多苦头，先把自己的经验奉上，1，对载体与基因片段进行分析，如GC含量，二级结构，大片段之所以连接不上很有可能是片段大形成螺旋结构降低连接碰撞机率，建 ...

谢谢非常感谢

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