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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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[求助] 大片段连接大载体难以连接的问题已有4人参与

最近做实验，大片段连接大载体。
载体、片段用相同的酶双酶切后回收，再连接。
（1）载体10000、片段4000，（2）载体12700、片段4334，改变体系做了3次。
第一次（1）长了1个，（2）长了好多，但是酶切验证都不对
第二次，第三次都没长单克隆。

连接时载体：片段为1:5，最大试过1:10，16度过夜或者8小时以上。
甚至，我连接酶都加了2ul（10ul的体系）

卡住了我在这，求指导，谢谢。

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1楼 2014-09-04 08:56:08

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zhangbighui

金虫 (正式写手)

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专业: 病毒学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-09-04 14:32:05
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:29:06

对于大片段连接的确是一个很难的问题，我在这上面也受了很多苦头，先把自己的经验奉上，1，对载体与基因片段进行分析，如GC含量，二级结构，大片段之所以连接不上很有可能是片段大形成螺旋结构降低连接碰撞机率，建议在加入连接酶的同时加入拓朴异构酶（promega有卖），可以提高阳性率;2，可采取分段连接的策略，在载体上寻找一个大小合适单酶切从位点切下，进行三片段连接，我用这个方法连接过几个大片段都好用，不过平端的话得验证连接顺序有点麻烦;3,运用IN-Fusion技术进行无缝连接，但对于大片段PCR扩增时需要高保真酶，由于PCR有一定的错误几率，我一般是先将PCR产物连接克隆载体，测序正确后，在克隆载体上切下来去IN-Fusion连接，效果也不错