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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大片段连接大载体难以连接的问题
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
像大载体连接，一般加多少比较好？100ng好还是200ng好？
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11楼2014-09-04 11:33:45
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangbighui at 2014-09-04 10:38:25
对于大片段连接的确是一个很难的问题，我在这上面也受了很多苦头，先把自己的经验奉上，1，对载体与基因片段进行分析，如GC含量，二级结构，大片段之所以连接不上很有可能是片段大形成螺旋结构降低连接碰撞机率，建 ...

像大载体连接，一般加多少比较好？100ng好还是200ng好？
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12楼2014-09-04 11:34:05
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 11:14:04
比例用的是摩尔比吗？

是的   1:5

问下  大载体的话一般用多少量是比较合适的呢
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13楼2014-09-04 11:39:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 11:14:04
比例用的是摩尔比吗？

是的  1:5
问下   像10000bp+的载体    用多少量比较好呢   100-200ng左右还是几十ng？
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14楼2014-09-04 11:41:07
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+3, ★有帮助 2014-09-04 15:07:17
大片段连接pET-28a表达载体
http://muchong.com/html/201204/4322991.html
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15楼2014-09-04 12:02:19
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-09-04 15:03:54
引用回帖:
14楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-09-04 11:41:07
是的  1:5
问下   像10000bp+的载体    用多少量比较好呢   100-200ng左右还是几十ng？...

我的载体酶切后最大的8 kb，1:10，因为回收浓度低，只用100 - 200 ng。
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16楼2014-09-04 14:11:54
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 14:11:54
我的载体酶切后最大的8 kb，1:10，因为回收浓度低，只用100 - 200 ng。...

thanks
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17楼2014-09-04 15:03:31
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhenwuhuang at 2014-09-04 12:02:19
大片段连接pET-28a表达载体
http://muchong.com/html/201204/4322991.html

thanks
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18楼2014-09-04 15:05:03
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hihe99

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我前段查clontech的in-fusion，查到个用T4 dna聚合酶做的，但是自己没试过。
我不知道怎么上传，题目是One-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC): Rapid and versatile cloning method for functional genomics studies，第一作者Jae-Yeon Jeong，方法在Supplementary Protocol里
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19楼2014-09-04 19:00:44
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hihe99

银虫 (小有名气)
如果lz试了，可以用的话麻烦分享下吧，我主要是实验室没有现成的酶，要不然我就试着用这种方法做了
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20楼2014-09-04 19:02:38
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