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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 大片段连接大载体难以连接的问题 已有4人参与

最近做实验,大片段连接大载体。
载体、片段用相同的酶双酶切后回收,再连接。
(1)载体10000、片段4000,(2)载体12700、片段4334,改变体系做了3次。
第一次(1)长了1个,(2)长了好多,但是酶切验证都不对
第二次,第三次都没长单克隆。

连接时载体:片段为1:5,最大试过1:10,16度过夜或者8小时以上。
甚至,我连接酶都加了2ul(10ul的体系)

卡住了我在这,求指导,谢谢。
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
鬼羽帝魂: 金币+2, 有帮助 2014-09-04 15:03:54
引用回帖:
14楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-09-04 11:41:07
是的  1:5
问下   像10000bp+的载体    用多少量比较好呢   100-200ng左右还是几十ng?...

我的载体酶切后最大的8 kb,1:10,因为回收浓度低,只用100 - 200 ng。
16楼2014-09-04 14:11:54
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czfscf

金虫 (正式写手)

同求知道,我也有个片段一直接不上。不过建议楼主可以用下同源重组酶,就是要重新设计引物
Ecological Genomics;the scientific walking hormone
2楼2014-09-04 09:13:23
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by czfscf at 2014-09-04 09:13:23
同求知道,我也有个片段一直接不上。不过建议楼主可以用下同源重组酶,就是要重新设计引物

老板太抠   不让用这个
3楼2014-09-04 09:15:06
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+15, 有帮助, 2 2014-09-04 10:12:21
楼主可以试一试20UL体系!双酶切时候可以过夜!
4楼2014-09-04 09:52:00
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