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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR退火温度为什么要设置程序升温？
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淡水三年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR退火温度为什么要设置程序升温？ 已有3人参与

最近做PCR，文献中的PCR条件中退火温度是50~60°C，1min，很不明白这个温度条件是什么意思，在PCR仪上要怎么设定？
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1楼 2014-08-18 19:17:17
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
淡水三年: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-19 19:34:46
是退火温度梯度实验吧，同一个体系下，不同的退火温度，可能会有不同的结果条带，看在哪个温度下扩增的最好，条带清晰单一，在合成一个新的质粒或基因组插入片段之类的，有时会应用到退火温度梯度实验，和引物浓度梯度，模板浓度梯度等等，根据实际情况而定。至于怎么设定，有可以做这个的PCR仪，设置一个最低退火温度，和一个最高的退火温度，每一个竖排都是一个温度，把样品放入你想用的温度里就行，如果没有这种PCR仪，只能多用几台PCR仪了，每台设定不同的退火温度进行试验。希望对你有所帮助。
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2楼2014-08-18 20:17:05
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孙妙妙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:39:38
是温度梯度的意思，百乐的PCR仪就有这个功能，一般用来摸索退火温度的，设一个温度范围会有8个温度，你可以8个都做，也可以选其中的温度做
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好好做实验！
3楼2014-08-18 22:38:23
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
也许他的意思只是这个温度范围内随便哪个都可以做。
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4楼2014-08-19 07:57:11
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jpfwx

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:39:47
这个应该是说程序退火温度，例如60-50℃，每个循环降低0.5或者1℃，这样可以保证在不同退火温度下都能扩增出你想要的目的条带，然后根据引物的退火温度继续扩增35cycles。大部分PCR仪都有这个功能的。
也可以像二楼说的，先摸索退火温度。
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年轻，拼搏
5楼2014-08-19 08:57:44
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淡水三年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-18 20:17:05
是退火温度梯度实验吧，同一个体系下，不同的退火温度，可能会有不同的结果条带，看在哪个温度下扩增的最好，条带清晰单一，在合成一个新的质粒或基因组插入片段之类的，有时会应用到退火温度梯度实验，和引物浓度梯 ...

今天做了一下，条带出来了，但不是目标条带，根据文献，目标条带应该是389bp，但是我跑出来是750bp，跑了两次都这样，能不能帮忙分析下怎么回事？
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6楼2014-08-19 19:39:12
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淡水三年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-08-19 07:57:11
也许他的意思只是这个温度范围内随便哪个都可以做。

今天做了一下，确实都能出条带，可惜都没有目标条带，跑出来比目标条带多了一倍
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7楼2014-08-19 19:41:33
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ksws0465326

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 淡水三年 at 2014-08-19 19:39:12
今天做了一下，条带出来了，但不是目标条带，根据文献，目标条带应该是389bp，但是我跑出来是750bp，跑了两次都这样，能不能帮忙分析下怎么回事？...

大概说下你的反应内容，一，用的什么模板？质粒还是基因组，模板用内切酶鉴定是否正确，二，使用引物是否正确？三，用的什么聚合酶？Taq，EX Taq还是其他的？四，反应体系，和条件具体是怎样的？有时虽然文献是那么写的，但你实际操作起来不一定适合你的这个反应，各种物质的浓度，在体系中的浓度等等。你说跑出来是750bp我觉得很大程度上是引物弄错了。
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8楼2014-08-19 21:16:25
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jpfwx

金虫 (小有名气)
最大可能是引物的问题，序列不对，专一性不够。
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年轻，拼搏
9楼2014-08-21 09:05:49
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liuzhenhai

铁杆木虫 (正式写手)
保密需要。

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10楼2014-08-21 09:33:06
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