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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR不同模板 退火温度不一样
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR不同模板 退火温度不一样 已有2人参与

各位同仁，本人用基因组DNA进行PCR扩增，出现了一个很奇怪的现象，只是模板不是一块提取的，同样的引物，其他条件都一样，但是却在不同的退火温度处出现目的条带，有的在64度，有的在这个温度扩增不出来，而是在56度处出现目的条带，请问这是怎么一回事呢  希望大家指点迷津
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1楼 2013-12-31 09:16:49
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海豚湾小鱼

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-12-31 12:44:37
我觉得应该是非特异性扩增吧，扩增出来的片段很有可能不是你所想要的。原因有很多，你有提到模板质量可能不一样，这是原因之一。退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。建议重复做下，看看是什么样的结果，或者把你扩增处理的片段去送测。
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2楼2013-12-31 11:24:45
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achonghello

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-02 08:35:20
同意楼上的，估计是非特异性扩增
一般同样的引物无论什么模板都是差不多温度的。。。。
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3楼2013-12-31 13:53:34
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 海豚湾小鱼 at 2013-12-31 11:24:45
我觉得应该是非特异性扩增吧，扩增出来的片段很有可能不是你所想要的。原因有很多，你有提到模板质量可能不一样，这是原因之一。退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时 ...

我将64度扩增的片段测序后是我要的目的片段
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4楼2013-12-31 14:12:11
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海豚湾小鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 14:12:11
我将64度扩增的片段测序后是我要的目的片段...

恩恩，能P出来自己想要的片段就好。出现别的带，应该是引物特异性不强，出现非特异性扩增了。
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5楼2013-12-31 17:10:00
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 海豚湾小鱼 at 2013-12-31 17:10:00
恩恩，能P出来自己想要的片段就好。出现别的带，应该是引物特异性不强，出现非特异性扩增了。...

但有的模板在64度P不出来 在56度能P出来  这是怎么回事啊
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6楼2014-01-01 20:39:31
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海豚湾小鱼

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-05 16:03:04
引用回帖:
6楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-01-01 20:39:31
但有的模板在64度P不出来 在56度能P出来  这是怎么回事啊...

56 p出来的不是你要的片段吧。其实本质就是你的引物特异性不强，我们称64度p出来的片段为A，56度P出来的片段为B。A,B两个片段和你的引物处于竞争关系，在一个大体系各物质随机碰撞的过程中，有可能以A的反应为主导，有可能以B的反应为主导。你要是觉得这个你的实验有影响的话，建议重新设计引物。
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7楼2014-01-04 10:09:38
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