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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于测序结果碱基丢失
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于测序结果碱基丢失 已有5人参与

实验终目的是做细胞定位，根据CDS序列设计引物，提拟南芥WT的RNA再反转成cDNA，由此扩目的片段，条带大小也正确，不到700bp。送去测序的是质粒（把目的片段和Blunt载体连上，在kana板上长的就不太好，大概只长出了3个菌落，菌p条带是正确的），结果测序结果显示在219-221丢失了3个碱基（DNAman分析）。第一次测序时是直接测的胶回收后的目的片段，没连blunt；第二次师兄说最好连上载体，但两次测序结果一样，都是丢失了3个碱基。
像这种突变说是发生概率不高，实在是不知道为什么，接下来我预想采取的措施是：1、换个公司重测下质粒   2、重新挑菌再提质粒   3、重新扩目的片段不知大家还有什么更好的办法或我在实验中需要注意什么，第一次构建就卡在了开头，科研真心不易，谢谢大家，祝大家实验顺利！
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1楼 2014-08-14 10:21:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-08-14 18:43:02
很正常的，才开始肯定会出现各种各样的问题，比如我吧，开始PCR ASCT2 和 GLS1基因，尝试了很多条件才试出来，然后连T载体去测序，发现一直连不上，最后发现居然是T载体出现了问题。所以说，科研路不是那么简单的。你这种情况可以再次PCR试试，用高保真的酶~产物还是要连接质粒载体的，我们一般是连接T载体，然后送去测序~不管怎么样，加油吧！要有耐心！不放弃~也许，成功就在你下一次实验！
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2楼2014-08-14 12:45:42
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
落叶的轨迹(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-16 12:44:58
点突变是定点突变，不是只能对一个碱基进行突变。在缺失的碱基上下游各选10bp左右的碱基设计正反方向引物，再加上F、R端的引物，采用融合PCR方式就可以了！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
14楼2014-08-16 10:20:30
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普通回帖

落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-14 12:45:42
很正常的，才开始肯定会出现各种各样的问题，比如我吧，开始PCR ASCT2 和 GLS1基因，尝试了很多条件才试出来，然后连T载体去测序，发现一直连不上，最后发现居然是T载体出现了问题。所以说，科研路不是那么简单的。 ...

嗯嗯谢谢你，下次换换载体和高保真酶。

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3楼2014-08-14 21:45:39
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chenziping

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR扩增是不是出现问题，碱基丢失
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4楼2014-08-15 00:41:11
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenziping at 2014-08-15 00:41:11
PCR扩增是不是出现问题，碱基丢失

恩，现在准备重新pcr。觉得苗出问题可能性不是很大，如果不是野生型那条带不会对

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5楼2014-08-15 07:26:51
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499649610

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-15 11:53:22
落叶的轨迹: 金币+2, ★有帮助 2014-08-15 18:18:21
用高保真酶，理论上就是takara的rTaq的错配率就不会高于0.5%，700bp，用EX估计就够，以前我构建载体时，Pcr用的是Primer star，你可以试试，保真性很好
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6楼2014-08-15 08:45:45
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
落叶的轨迹: 金币+3, ★有帮助 2014-08-15 18:18:05
这种情况我也遇到过，PCR结果与基因库中的序列对比总是在相同的位置出现相同的点突变，可能是基因库中的突变型吧！然后没有再继续在cDNA中扩增，通过融合PCR对模板进行点突变，得到基因库中序列相同的目的片段，所以你也可以考虑将其突变回来。祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
7楼2014-08-15 12:08:50
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 499649610 at 2014-08-15 08:45:45
用高保真酶，理论上就是takara的rTaq的错配率就不会高于0.5%，700bp，用EX估计就够，以前我构建载体时，Pcr用的是Primer star，你可以试试，保真性很好

用的就是这个酶的

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8楼2014-08-15 18:14:27
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wangranjun at 2014-08-15 12:08:50
这种情况我也遇到过，PCR结果与基因库中的序列对比总是在相同的位置出现相同的点突变，可能是基因库中的突变型吧！然后没有再继续在cDNA中扩增，通过融合PCR对模板进行点突变，得到基因库中序列相同的目的片段，所以 ...

我的结果比理想序列少了3个碱基，也可以进行点突变？

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9楼2014-08-15 18:17:34
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
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9楼: Originally posted by 落叶的轨迹 at 2014-08-15 18:17:34
我的结果比理想序列少了3个碱基，也可以进行点突变？
...

可以呀！设计引物就好了！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
10楼2014-08-15 21:24:52
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