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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化问题，求高手指教
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sunday1234

新虫 (小有名气)

[求助] DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化问题，求高手指教 已有3人参与

我要纯化的蛋白等电点为5.9，用DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化，用PBS还是tris缓冲液，缓冲液PH为多少合适，用不同浓度NaCl洗脱时，怎么知道目的蛋白什么时候被洗脱下来？我是新手，求指教？
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1楼 2014-07-28 22:54:31
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体积收集一管样品，做活性检测，就知道你的蛋白什么离子强度下被洗脱了。
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2楼2014-07-29 08:28:12
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sunday1234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-29 08:28:12
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体 ...

谢谢你！是不是阴离子交换柱都是用Tris-HCl缓冲液?
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3楼2014-07-29 17:58:12
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sunday1234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-29 08:28:12
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体 ...

我还有个疑问，查资料说强阴离子对蛋白质活性有影响。使用强或弱阴历交换时如何界定的呢，ph为多少用强的，为多少用弱的呢
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4楼2014-07-29 18:33:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
弱阴的结合强度比强阴弱，缓冲液只比等电点高0.5-1个pH单位的时候，用弱阴相当于不能结合。

每一步纯化步骤都有可能造成损失，操作过程中有损失，分析样品的时候要取一小部分样品也有损失，跟层析柱结合再被洗脱之后可能会对蛋白质结构有影响也可能会造成损失。但是在一切都等于未知时，首先要确保的是实验能进行，也就是说——使蛋白质被吸附在层析柱中（这个是一切的前提），所以你的首选为强阴，不行才换用弱阴。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2014-07-30 04:50:40
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白羽枪

铜虫 (初入文坛)
我最近也想用DEAE阴离子交换纯化蛋白。实验室没人做过，不直到怎么下手。能不能共享一下你的实验步骤，谢谢。邮箱：shijing0213@foxmail.com。
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6楼2014-07-30 10:29:22
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sunday1234 at 2014-07-29 18:33:39
我还有个疑问，查资料说强阴离子对蛋白质活性有影响。使用强或弱阴历交换时如何界定的呢，ph为多少用强的，为多少用弱的呢...

首先要阐明一点的就是，阴离子交换的强弱区别就是pH作用范围的宽泛与狭窄。强离子交换介质的pH作用范围宽，可以在你不清楚样品等电点的情况下使用，弱离子交换介质的pH作用范围窄，样品等电点明确的情况下可以用。和pH值本身关系不大。
至于对活性的影响，如果你选弱阴，pH调节不正确，也会导致活性丢失，一切的一切，都要看你的pH。甚至有的时候你的pH不能满足做阴离子，就得用阳离子了。建议你好好读一下GE的离子交换手册。写的比较详细。
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7楼2014-08-01 12:59:23
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by sunday1234 at 2014-07-29 17:58:12
谢谢你！是不是阴离子交换柱都是用Tris-HCl缓冲液?...

也不全是Tris-HCL，还有PB,PBS，柠檬酸等等。
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8楼2014-08-01 13:20:04
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cpu_haoxia

金虫 (小有名气)
你好，我想问一个简单的问题，使用这种柱子是必须要和相应的离子交换色谱仪相连呢还是单纯一根柱子或者和液相相连呢？谢谢
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相信自己
9楼2014-09-05 09:33:10
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liaohongjun

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般阴离子交换层析是不选用PB或者PBS缓冲液的，因为磷酸缓冲液能与阴离子交换介质发生反应！至于上样pH，弱阴离子交换层析，在不含盐的情况下，一般高于pI一个pH左右就OK了，但要考虑到你杂蛋白的水平，一切都要以纯化表来评估！
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10楼2016-11-15 16:28:23
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