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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化问题，求高手指教
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sunday1234

新虫 (小有名气)

[求助] DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化问题，求高手指教 已有3人参与

我要纯化的蛋白等电点为5.9，用DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化，用PBS还是tris缓冲液，缓冲液PH为多少合适，用不同浓度NaCl洗脱时，怎么知道目的蛋白什么时候被洗脱下来？我是新手，求指教？
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1楼 2014-07-28 22:54:31
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sunday1234 at 2014-07-29 18:33:39
我还有个疑问，查资料说强阴离子对蛋白质活性有影响。使用强或弱阴历交换时如何界定的呢，ph为多少用强的，为多少用弱的呢...

首先要阐明一点的就是，阴离子交换的强弱区别就是pH作用范围的宽泛与狭窄。强离子交换介质的pH作用范围宽，可以在你不清楚样品等电点的情况下使用，弱离子交换介质的pH作用范围窄，样品等电点明确的情况下可以用。和pH值本身关系不大。
至于对活性的影响，如果你选弱阴，pH调节不正确，也会导致活性丢失，一切的一切，都要看你的pH。甚至有的时候你的pH不能满足做阴离子，就得用阳离子了。建议你好好读一下GE的离子交换手册。写的比较详细。
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7楼2014-08-01 12:59:23
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体积收集一管样品，做活性检测，就知道你的蛋白什么离子强度下被洗脱了。
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2楼2014-07-29 08:28:12
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sunday1234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-29 08:28:12
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体 ...

谢谢你！是不是阴离子交换柱都是用Tris-HCl缓冲液?
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3楼2014-07-29 17:58:12
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sunday1234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-29 08:28:12
一般来说，比蛋白等电点高0.5~1个pH的缓冲液即可，但是你的等电点低于7.0，还是建议你用强阴离子交换，比如Q来结合蛋白。
缓冲液用tris-HCl比较理想，你可以在实验时先进行一次20个柱体积的线性梯度洗脱，每1个柱体 ...

我还有个疑问，查资料说强阴离子对蛋白质活性有影响。使用强或弱阴历交换时如何界定的呢，ph为多少用强的，为多少用弱的呢
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4楼2014-07-29 18:33:39
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