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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 天然药物化学 » DEAE柱多糖上样量过载的问题
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陶盛昌

木虫 (正式写手)

[求助] DEAE柱多糖上样量过载的问题 已有2人参与

各位虫友，我用DEAE纤维素纯化多糖，第一次上样300mg，水洗脱的曲线如图一， 其不同浓度的盐洗脱曲线的吸光度都很小，最大都不过0.2。其中之一，0.3Mol/lNacl洗脱液吸光度如图二。然后第二次上样就加大了上样量，上样量 为1g，其水洗脱曲线如图三，感觉很不正常，是不是上样量过载了？
在此，请教虫友三个问题：
     1. 为什么各种不同浓度盐洗脱时，测得吸光度都那么小，是没有什么酸性多糖吗？但我水洗脱的多糖也才18.9%。
     2.上样1g，水洗脱的曲线很不正常，各位能帮我分析下吗，是不是上样量过载？
     3. 实验接下来该如何处理和进行，请各位给些建议，谢谢。
有价值的建议将大量追加金币！

DEAE柱多糖上样量过载的问题
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DEAE柱多糖上样量过载的问题-1
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DEAE柱多糖上样量过载的问题-2
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@@@@@@
1楼 2014-07-02 15:32:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
辣笔v小新: 金币+1, 鼓励应助交流 2014-07-15 02:44:28
用水洗脱有很强的吸收峰出现，表明你的多糖没有挂上柱子，被洗脱下来了。所以你用盐浓度梯度去洗脱的时候，没有吸收峰。另外，你没有做线性梯度，在不同盐浓度下，多糖的分配系数不同，但有可能也会被洗脱。这样就一点一点洗下来了。造成你后期高盐时候洗的还是一点点。你把总量收集下来看看还是不是300mg就知道了。
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5楼2014-07-03 11:34:19
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fengzshang

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 陶盛昌 at 2014-07-17 09:21:41
谢谢，我继续往后面试试，我的多糖是从茎中提取的，请教一下，淀粉用什么方法除去好？...

淀粉，我们一般用a-淀粉酶，简单而且便宜
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10楼2014-07-18 00:26:08
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YR-王

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 陶盛昌 at 2014-07-03 09:57:04
先谢谢你！
1.我不是用流传模式做的；
2.我在第一次上样时，用各种不同浓度的盐洗脱过，高浓度的盐也有用过，0.05,0.1,0.3,0.5,1.0,2.0mol/l的NACL分别洗脱测过吸光度，吸光度都很小，所以第二次上样才增大上样量 ...

师兄，您的这个实验还看吸收度。我想问下，您的吸收度是在多少波长下测定的呢？而且你是知道这是酸性多糖才用吸光度作为一个衡量指标的吗
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15楼2016-02-19 15:48:39
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普通回帖

wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
陶盛昌: 金币+8, ★有帮助 2014-07-03 09:50:07
辣笔v小新: 金币+1, 鼓励应助交流 2014-07-15 02:45:48
师兄，根据你图一和图二结合的来看，你的多糖应该是没挂在DEAE柱子上，请问你是用流穿模式做的吗？
根据你图三的显示，你洗脱盐浓度不够高，不能一次性洗脱样品，建议你增加盐浓度。
不知道你具体的实验方案怎么设置，我的建议是，确定你目标产物的收率，纯度，活性的指标。然后测试DBC,拉梯度测试最佳洗脱盐浓度，优化洗脱方式，测试样品指标，继续优化。不知道对你的实验有帮助没有。
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2楼2014-07-03 09:37:27
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
辣笔v小新: 金币+1, 鼓励应助交流 2014-07-15 02:44:48
此外，还需要考虑，你的多糖可能与DEAE柱不结合，建议调节pH后，用Q柱尝试一下。或者你用CM柱
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3楼2014-07-03 09:38:39
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-03 09:37:27
师兄，根据你图一和图二结合的来看，你的多糖应该是没挂在DEAE柱子上，请问你是用流穿模式做的吗？
根据你图三的显示，你洗脱盐浓度不够高，不能一次性洗脱样品，建议你增加盐浓度。
不知道你具体的实验方案怎么设 ...

先谢谢你！
1.我不是用流传模式做的；
2.我在第一次上样时，用各种不同浓度的盐洗脱过，高浓度的盐也有用过，0.05,0.1,0.3,0.5,1.0,2.0mol/l的NACL分别洗脱测过吸光度，吸光度都很小，所以第二次上样才增大上样量到1g的；
3.我查过文献，有人也是用这种过柱子的方法将我所做的原料的多糖纯化了的，应该说是可行的。我想问一下，“根据你图一和图二结合的来看，你的多糖应该是没挂在DEAE柱子上”这具体是怎么看出来的？能跟我详细说说吗，谢谢！
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@@@@@@
4楼2014-07-03 09:57:04
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fengzshang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
辣笔v小新: 金币+1, 鼓励应助交流 2014-07-15 02:44:06
陶盛昌: 金币+5, ★有帮助 2014-07-16 15:23:09
1. 是不是过载和柱体积有很大联系，你上样量1g的话，柱体积最少要在500ml以上。
2.Nacl洗脱曲线的吸光度小，多半是因为你的Nacl浓度不够大，说明你的酸性多糖含-COOH的太多，需要提高Nacl浓度，试试1M或者更高，我推荐你用梯度洗脱（0-1.5M）
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6楼2014-07-14 16:00:36
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fengzshang at 2014-07-14 16:00:36
1. 是不是过载和柱体积有很大联系，你上样量1g的话，柱体积最少要在500ml以上。
2.Nacl洗脱曲线的吸光度小，多半是因为你的Nacl浓度不够大，说明你的酸性多糖含-COOH的太多，需要提高Nacl浓度，试试1M或者更高，我 ...

谢谢你的回答，
1.可能1g的上样量是有点大，我最近又上样了一次600mg，曲线也和图三差不多，结果不是很好，可能是过载，也有可能是其他原因，我的多糖比较黏，我超声溶解过后（感官上是没有什么不溶物了），就没有去离心和用滤膜过滤，以前用0.45微米的微孔滤膜过滤过一次，感觉很难过滤。你觉得有没有这方面的原因？
2.Nacl洗脱曲线的吸光度小，这个我后面也做过1M和2MNacl浓度的洗脱，吸光度也都很小，你说我是不是应当测下他的糖醛酸的含量，以检测他到底有没有酸性多糖？
虚心请教，望指教，谢谢！
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@@@@@@
7楼2014-07-16 15:22:57
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fengzshang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
陶盛昌: 金币+7, ★有帮助 2014-07-17 09:18:42
引用回帖:
7楼: Originally posted by 陶盛昌 at 2014-07-16 15:22:57
谢谢你的回答，
1.可能1g的上样量是有点大，我最近又上样了一次600mg，曲线也和图三差不多，结果不是很好，可能是过载，也有可能是其他原因，我的多糖比较黏，我超声溶解过后（感官上是没有什么不溶物了），就没有 ...

1.建议你测一下你的粗提物里面是不是有糖醛酸
2. 如果有，检查是否上样过量，也可以在你的水洗脱出来的部分检测是否有糖醛酸，如果有就说明过量。
3. 如果你的多糖粘度很高，你可以降低浓度嘛，比如你之前是600mg 溶于10ml，现在可以用20ml甚至更多。
4.另外你的多糖是植物中提取的？哪个部位，有没有测过淀粉含量？一般根茎类药材含淀粉类比较多。一般情况下，淀粉是要先去除的，一来淀粉没有啥生物活性，二来影响分离效果。
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8楼2014-07-16 15:42:38
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fengzshang at 2014-07-16 15:42:38
1.建议你测一下你的粗提物里面是不是有糖醛酸
2. 如果有，检查是否上样过量，也可以在你的水洗脱出来的部分检测是否有糖醛酸，如果有就说明过量。
3. 如果你的多糖粘度很高，你可以降低浓度嘛，比如你之前是600m ...

谢谢，我继续往后面试试，我的多糖是从茎中提取的，请教一下，淀粉用什么方法除去好？
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@@@@@@
9楼2014-07-17 09:21:41
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