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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] DEAE FF 纯化商品酶,只有一个峰 已有2人参与

实验(1)上样缓冲液:Tris-Hcl +0.01M Nacl,pH 7.0 ,洗脱缓冲液:Tris-Hcl +1.0 M Nacl,pH 7.0 ,进样2ml/次,共两次,洗脱时,0-100%,这时峰就一起出来了。(第一次做实验,缓冲液也没有抽滤,出现了毛刺峰,这个问题之前请教过大家了)
实验(2)上样缓冲液:Tris-Hcl +0.01M Nacl,pH 7.0 ,洗脱缓冲液:Tris-Hcl +0.5M Nacl,pH 7.0 ,进样2ml/次,共两次,洗脱时,0-30%,30%-70%,705-100%,但是只在低盐浓度时有一个峰出现,后面的就没有峰了,柱子上有很重的颜色没有洗下来。

关于这个实验,有几点不明白的地方:1、实验(1)中的峰在50%洗脱时差不多都洗脱下来了,为什么实验(2)中在相当浓度(70%-100%)时反而没有样品洗下来呢?是不是因为实验(1)梯度射的陡了?
2、吸附在柱子上的颜色较重的样品,后面用水冲洗,能下下来一部分,再用20%乙醇冲洗,大部分洗下来了,但是还有一些洗不掉了。问过一个老师,他说可能是我的缓冲液不合适,但是我查了下,pH7.0 的缓冲液,GE 柱子说明书上推荐的,pH6.0-7.0  的是 bis-tris,pH 6.2-7.2 的是 bis-tris propane ,我查了下, bis-tris是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]甲烷, bis-tris propane是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷。这些缓冲液差别应该和tris差不多吧?
3、上样缓冲液是不是该添加Nacl呢?不加的话是不是有疏水作用,影响吸附?

DEAE FF 纯化商品酶,只有一个峰
0.5M 洗脱缓冲液.JPG


DEAE FF 纯化商品酶,只有一个峰-1
1M 洗脱缓冲液.JPG
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long,longlong.
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

童鞋们来帮忙啦!
long,longlong.
2楼2014-08-14 09:34:15
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢指导! 2014-08-19 14:04:47
从电导的变化上看,柱子里有气泡了,为什么不手动梯度洗脱,而用线性洗脱?线性洗脱分离不好,就是方便。梯度洗脱可以自己控制盐的浓度,分离的别较好。(1)蛋白的洗脱,这和离子浓度与流速有关(2)洗脱不下来的可能也有色素存在,可考虑用0.5的氢氧化钠清洗,具体方法可以见柱子的再生。(3)添加Nacl影响并不大。我们一般用泵进样,这样可以进入大量发酵液,我曾经直接进入过两升发酵液,这样目的蛋白会很多,然后用手动洗脱每次增加5%的盐浓度,洗到50%后改用线性洗脱,一般50%后我的目的蛋白几乎没有了。
3楼2014-08-14 19:07:34
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复!受教了! 2014-08-19 14:12:00
给你几个建议:
1,实验(1)的线性洗脱体积不够,从图谱上看,没分开,峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后,做peak cutting。
2.上样别加NaCl,Cl离子是DEAE的标准反离子,影响吸附。
3. 调节pH,上样pH在等电点以上,洗脱pH在等电点以下。这个你看一下GE的阴离子交换层析手册。
4. 0.5M的线性梯度还可以优化一下,如果只有一个峰的话,证明离子强度太低,还有东西在柱子上没洗下来。
4楼2014-08-15 17:33:24
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanbo934 at 2014-08-14 19:07:34
从电导的变化上看,柱子里有气泡了,为什么不手动梯度洗脱,而用线性洗脱?线性洗脱分离不好,就是方便。梯度洗脱可以自己控制盐的浓度,分离的别较好。(1)蛋白的洗脱,这和离子浓度与流速有关(2)洗脱不下来的可 ...

我用的是DEAE1ml的柱子,从电泳效果来看,大部分的样品是没有吸附上去的,这样是不是说其实是样品量已经足够了?还是说知识没有吸附上去?我看了柱子的说明书,说是吸附量为50mg,其实我想分离的样品是在分子量在60KD之上的四条带,希望得到他们单独的条带,如下图中的32 、47中的几条带,希望能够单独分出来。
DEAE FF 纯化商品酶,只有一个峰-2
20140819.jpg

long,longlong.
5楼2014-08-19 14:11:00
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-08-15 17:33:24
给你几个建议:
1,实验(1)的线性洗脱体积不够,从图谱上看,没分开,峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后,做peak cutting。
2.上样别加NaCl,Cl离子是DEAE的标准反离子,影响吸附。
3. 调节pH,上样 ...

谢谢回复!我看了GE 的说明书,一般离子交换上样和洗脱缓冲液,差别就只有盐浓度,pH是不会变的,如果pH 变化,盐离子浓度再变化,我这个实验的不稳定因素就太多了,而且,pH 变化这个条件也不好控制,如下图,我想得到如编号32和47这两管的4条带的单独条带,
DEAE FF 纯化商品酶,只有一个峰-3
20140819.jpg

long,longlong.
6楼2014-08-19 14:40:07
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