| 查看: 1517 | 回复: 5 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
dongjiqiao铁杆木虫 (著名写手)
|
[求助]
DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰 已有2人参与
|
|
|
实验（1）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +1.0 M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-100%，这时峰就一起出来了。（第一次做实验，缓冲液也没有抽滤，出现了毛刺峰，这个问题之前请教过大家了） 实验（2）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +0.5M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-30%，30%-70%,705-100%，但是只在低盐浓度时有一个峰出现，后面的就没有峰了，柱子上有很重的颜色没有洗下来。 关于这个实验，有几点不明白的地方：1、实验（1）中的峰在50%洗脱时差不多都洗脱下来了，为什么实验（2）中在相当浓度（70%-100%）时反而没有样品洗下来呢？是不是因为实验（1）梯度射的陡了？ 2、吸附在柱子上的颜色较重的样品，后面用水冲洗，能下下来一部分，再用20%乙醇冲洗，大部分洗下来了，但是还有一些洗不掉了。问过一个老师，他说可能是我的缓冲液不合适，但是我查了下，pH7.0 的缓冲液，GE 柱子说明书上推荐的，pH6.0-7.0 的是 bis-tris,pH 6.2-7.2 的是 bis-tris propane ,我查了下， bis-tris是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]甲烷， bis-tris propane是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷。这些缓冲液差别应该和tris差不多吧？ 3、上样缓冲液是不是该添加Nacl呢？不加的话是不是有疏水作用，影响吸附？  0.5M 洗脱缓冲液.JPG  1M 洗脱缓冲液.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感
已经有10人回复
-
今天务委会开完了，明天出结果吗
已经有11人回复
-
有没有大神帮我看看基金代码
已经有9人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有23人回复
-
在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。
已经有8人回复
-
今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果
已经有22人回复
-
放榜前的不淡定
已经有18人回复
-
什么时候开奖？
已经有13人回复
-
如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》
已经有8人回复
-
没有任何消息-是不是就凉了
已经有10人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 阴离子DEAE纯化酶，洗脱峰毛刺儿，洗脱后还有毛刺儿，希望得到中间条带的样品
已经有9人回复
- DEAE-Sepharose Fast Flow column纯化问题，求高手指教
已经有9人回复
- 多糖纯化关于DEAE
已经有9人回复
- DEAE——Sepharose离子交换纯化 流速变慢
已经有7人回复
- DEAE Sepharose-CL6B凝胶柱层析纯化阿拉伯木聚糖
已经有6人回复
- DEAE-Sepharose FF层析柱规格 及填料的预处理
已经有10人回复
- 关于 DEAE Sepharose FF 使用方法
已经有3人回复
- DEAE-纤维素阴离子交换树脂纯化多糖，柱子重生
已经有8人回复
- 蛋白纯化-过DEAE阴离子交换柱
已经有7人回复
- 使用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化蛋白后杂蛋白的洗脱
已经有7人回复
- DEAE-cellulose 52 纯化多糖
已经有15人回复
dongjiqiao
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6702.7
- 散金: 242
- 红花: 5
- 帖子: 1130
- 在线: 84.5小时
- 虫号: 680234
- 注册: 2008-12-23
- 性别: MM
- 专业: 环境微生物学
5楼2014-08-19 14:11:00
dongjiqiao
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6702.7
- 散金: 242
- 红花: 5
- 帖子: 1130
- 在线: 84.5小时
- 虫号: 680234
- 注册: 2008-12-23
- 性别: MM
- 专业: 环境微生物学
2楼2014-08-14 09:34:15
yuanbo934
至尊木虫 (著名写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 29 (小学生)
- 金币: 25197.3
- 红花: 4
- 帖子: 2977
- 在线: 230.7小时
- 虫号: 462771
- 注册: 2007-11-19
- 性别: GG
- 专业: 微生物资源与分类学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢指导！ 2014-08-19 14:04:47
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢指导！ 2014-08-19 14:04:47
| 从电导的变化上看，柱子里有气泡了，为什么不手动梯度洗脱，而用线性洗脱？线性洗脱分离不好，就是方便。梯度洗脱可以自己控制盐的浓度，分离的别较好。（1）蛋白的洗脱，这和离子浓度与流速有关（2）洗脱不下来的可能也有色素存在，可考虑用0.5的氢氧化钠清洗，具体方法可以见柱子的再生。（3）添加Nacl影响并不大。我们一般用泵进样，这样可以进入大量发酵液，我曾经直接进入过两升发酵液，这样目的蛋白会很多，然后用手动洗脱每次增加5%的盐浓度，洗到50%后改用线性洗脱，一般50%后我的目的蛋白几乎没有了。 |
3楼2014-08-14 19:07:34
wolfman840
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 225 (大学生)
- 金币: 3524.8
- 散金: 20
- 红花: 12
- 帖子: 702
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 902627
- 注册: 2009-11-14
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复！受教了！ 2014-08-19 14:12:00
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复！受教了！ 2014-08-19 14:12:00
|
给你几个建议： 1，实验（1）的线性洗脱体积不够，从图谱上看，没分开，峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后，做peak cutting。 2.上样别加NaCl，Cl离子是DEAE的标准反离子，影响吸附。 3. 调节pH，上样pH在等电点以上，洗脱pH在等电点以下。这个你看一下GE的阴离子交换层析手册。 4. 0.5M的线性梯度还可以优化一下，如果只有一个峰的话，证明离子强度太低，还有东西在柱子上没洗下来。 |
4楼2014-08-15 17:33:24
28