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dongjiqiao铁杆木虫 (著名写手)
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DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰 已有2人参与
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实验（1）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +1.0 M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-100%，这时峰就一起出来了。（第一次做实验，缓冲液也没有抽滤，出现了毛刺峰，这个问题之前请教过大家了） 实验（2）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +0.5M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-30%，30%-70%,705-100%，但是只在低盐浓度时有一个峰出现，后面的就没有峰了，柱子上有很重的颜色没有洗下来。 关于这个实验，有几点不明白的地方：1、实验（1）中的峰在50%洗脱时差不多都洗脱下来了，为什么实验（2）中在相当浓度（70%-100%）时反而没有样品洗下来呢？是不是因为实验（1）梯度射的陡了？ 2、吸附在柱子上的颜色较重的样品，后面用水冲洗，能下下来一部分，再用20%乙醇冲洗，大部分洗下来了，但是还有一些洗不掉了。问过一个老师，他说可能是我的缓冲液不合适，但是我查了下，pH7.0 的缓冲液，GE 柱子说明书上推荐的，pH6.0-7.0 的是 bis-tris,pH 6.2-7.2 的是 bis-tris propane ,我查了下， bis-tris是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]甲烷， bis-tris propane是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷。这些缓冲液差别应该和tris差不多吧？ 3、上样缓冲液是不是该添加Nacl呢？不加的话是不是有疏水作用，影响吸附？  0.5M 洗脱缓冲液.JPG  1M 洗脱缓冲液.JPG |
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dongjiqiao
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2楼2014-08-14 09:34:15
yuanbo934
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| 从电导的变化上看，柱子里有气泡了，为什么不手动梯度洗脱，而用线性洗脱？线性洗脱分离不好，就是方便。梯度洗脱可以自己控制盐的浓度，分离的别较好。（1）蛋白的洗脱，这和离子浓度与流速有关（2）洗脱不下来的可能也有色素存在，可考虑用0.5的氢氧化钠清洗，具体方法可以见柱子的再生。（3）添加Nacl影响并不大。我们一般用泵进样，这样可以进入大量发酵液，我曾经直接进入过两升发酵液，这样目的蛋白会很多，然后用手动洗脱每次增加5%的盐浓度，洗到50%后改用线性洗脱，一般50%后我的目的蛋白几乎没有了。 |
3楼2014-08-14 19:07:34
wolfman840
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给你几个建议： 1，实验（1）的线性洗脱体积不够，从图谱上看，没分开，峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后，做peak cutting。 2.上样别加NaCl，Cl离子是DEAE的标准反离子，影响吸附。 3. 调节pH，上样pH在等电点以上，洗脱pH在等电点以下。这个你看一下GE的阴离子交换层析手册。 4. 0.5M的线性梯度还可以优化一下，如果只有一个峰的话，证明离子强度太低，还有东西在柱子上没洗下来。 |
4楼2014-08-15 17:33:24
dongjiqiao
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dongjiqiao
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