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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰 已有2人参与

实验（1）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +1.0 M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-100%，这时峰就一起出来了。（第一次做实验，缓冲液也没有抽滤，出现了毛刺峰，这个问题之前请教过大家了）
实验（2）上样缓冲液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脱缓冲液：Tris-Hcl +0.5M Nacl，pH 7.0 ，进样2ml/次，共两次，洗脱时，0-30%，30%-70%,705-100%，但是只在低盐浓度时有一个峰出现，后面的就没有峰了，柱子上有很重的颜色没有洗下来。

关于这个实验，有几点不明白的地方：1、实验（1）中的峰在50%洗脱时差不多都洗脱下来了，为什么实验（2）中在相当浓度（70%-100%）时反而没有样品洗下来呢？是不是因为实验（1）梯度射的陡了？
2、吸附在柱子上的颜色较重的样品，后面用水冲洗，能下下来一部分，再用20%乙醇冲洗，大部分洗下来了，但是还有一些洗不掉了。问过一个老师，他说可能是我的缓冲液不合适，但是我查了下，pH7.0 的缓冲液，GE 柱子说明书上推荐的，pH6.0-7.0  的是 bis-tris,pH 6.2-7.2 的是 bis-tris propane ,我查了下， bis-tris是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]甲烷， bis-tris propane是1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷。这些缓冲液差别应该和tris差不多吧？
3、上样缓冲液是不是该添加Nacl呢？不加的话是不是有疏水作用，影响吸附？

DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰
0.5M 洗脱缓冲液.JPG


DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰-1
1M 洗脱缓冲液.JPG
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long,longlong.
1楼 2014-08-13 17:00:47
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-08-15 17:33:24
给你几个建议：
1，实验（1）的线性洗脱体积不够，从图谱上看，没分开，峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后，做peak cutting。
2.上样别加NaCl，Cl离子是DEAE的标准反离子，影响吸附。
3. 调节pH，上样 ...

谢谢回复！我看了GE 的说明书，一般离子交换上样和洗脱缓冲液，差别就只有盐浓度，pH是不会变的，如果pH 变化，盐离子浓度再变化，我这个实验的不稳定因素就太多了，而且，pH 变化这个条件也不好控制，如下图，我想得到如编号32和47这两管的4条带的单独条带，
DEAE FF 纯化商品酶，只有一个峰-2
20140819.jpg
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long,longlong.
6楼2014-08-19 14:40:07
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
童鞋们来帮忙啦！
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long,longlong.
2楼2014-08-14 09:34:15
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢指导！ 2014-08-19 14:04:47
从电导的变化上看，柱子里有气泡了，为什么不手动梯度洗脱，而用线性洗脱？线性洗脱分离不好，就是方便。梯度洗脱可以自己控制盐的浓度，分离的别较好。（1）蛋白的洗脱，这和离子浓度与流速有关（2）洗脱不下来的可能也有色素存在，可考虑用0.5的氢氧化钠清洗，具体方法可以见柱子的再生。（3）添加Nacl影响并不大。我们一般用泵进样，这样可以进入大量发酵液，我曾经直接进入过两升发酵液，这样目的蛋白会很多，然后用手动洗脱每次增加5%的盐浓度，洗到50%后改用线性洗脱，一般50%后我的目的蛋白几乎没有了。
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3楼2014-08-14 19:07:34
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复！受教了！ 2014-08-19 14:12:00
给你几个建议：
1，实验（1）的线性洗脱体积不够，从图谱上看，没分开，峰有平台期。建议你用30CV进行线性梯度洗脱后，做peak cutting。
2.上样别加NaCl，Cl离子是DEAE的标准反离子，影响吸附。
3. 调节pH，上样pH在等电点以上，洗脱pH在等电点以下。这个你看一下GE的阴离子交换层析手册。
4. 0.5M的线性梯度还可以优化一下，如果只有一个峰的话，证明离子强度太低，还有东西在柱子上没洗下来。
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4楼2014-08-15 17:33:24
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