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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

[求助] 载体是否自连 已有2人参与

最近在做克隆,但是出现了好多问题,请教各位前辈,给予帮助,不胜感激!!
1.引物-F-CAGT---------------------TTGT
           R-ATCC---------------------AATG
这对引物的扩增产物是否与PGEM-Teasy 载体连接


2.用上述引物扩增的目的片段与T载体连接后挑白斑,扩PCR后条带非常亮,但是所提取的质粒片段大于目的基因与载体连在一起的片段,单酶切也没有出现目的条带
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

1. 引物的扩增产物是否与PGEM-Teasy 载体连接
如果你用的是Taq酶扩增出来的,可以直接和pGEM T-easy,如果是高保真酶扩增出来的,需要先加A后,再和pGEM T-GEM连接

2. 扩PCR后条带非常亮
你是用什么引物做菌落PCR的,如何来排除假阳性的

3. 但是所提取的质粒片段大于目的基因与载体连在一起的片段,单酶切也没有出现目的条带
因为你的载体没有线性化,所以不好从大小上进行判断,单酶切也没有出现目的条带可能是因为你载体上只有一个这个位点
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-07-16 10:56:40
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-07-05 18:59:09
我也是刚刚做这个,直接做了个菌落PCR,就送出去测序了,纠结于是否自连还不如直接送几个样预测序一下,省时间
2楼2014-07-04 10:18:58
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