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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体是否自连
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银虫 (小有名气)

[求助] 载体是否自连 已有2人参与

最近在做克隆，但是出现了好多问题，请教各位前辈，给予帮助，不胜感激！！
1.引物-F-CAGT---------------------TTGT
           R-ATCC---------------------AATG
这对引物的扩增产物是否与PGEM-Teasy 载体连接


2.用上述引物扩增的目的片段与T载体连接后挑白斑，扩PCR后条带非常亮，但是所提取的质粒片段大于目的基因与载体连在一起的片段，单酶切也没有出现目的条带
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1楼 2014-07-04 09:54:14
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

1. 引物的扩增产物是否与PGEM-Teasy 载体连接
如果你用的是Taq酶扩增出来的，可以直接和pGEM T-easy，如果是高保真酶扩增出来的，需要先加A后，再和pGEM T-GEM连接

2. 扩PCR后条带非常亮
你是用什么引物做菌落PCR的，如何来排除假阳性的

3. 但是所提取的质粒片段大于目的基因与载体连在一起的片段，单酶切也没有出现目的条带
因为你的载体没有线性化，所以不好从大小上进行判断，单酶切也没有出现目的条带可能是因为你载体上只有一个这个位点
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-07-16 10:56:40
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-05 18:59:09
我也是刚刚做这个，直接做了个菌落PCR，就送出去测序了，纠结于是否自连还不如直接送几个样预测序一下，省时间
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2楼2014-07-04 10:18:58
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