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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定点突变PCR过程求教
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yingmeiqi

新虫 (小有名气)

[求助] 定点突变PCR过程求教 已有1人参与

大家好！我最近在做定点突变，有两个点需要突变，我是用Dpn1消化的方法来做的，引物设计的时候约40bp左右，突变的位置位于引物正中央，质粒约7000bp，用的酶是thermo的phusion，分别两个点进行突变的时候，都成功了，之后再做就没有东西，成功的那次发现PCR结束之后电泳能看到条带，不成功的时候电泳看不到条带，用来当模板的质粒经电泳检测，除在7000左右的位置有带外，在10000bp以上也出现条带，不知道质粒是否不纯，PCR结束之后发现引物二聚体比较亮。之前做过，发现如果PCR没有条带的时候，经Dpn1消化完，转化之后不长斑？
       体系中，模板稀释了10倍或5倍，引物稀释了五倍，均没有看到目的条带，循环数设置了18个，还加入了5%的DMSO。
       条件：1. 5 min @ 95C
                2. Repeat 18x
                (a) 50 s @ 95C
               (b) 50 s @ 60C
               (c) 10min  @ 68C
               3. 7 min @ 68C
大家能帮我分析下原因吗？
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1楼 2014-06-30 15:39:09
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yingmeiqi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuanyalizi at 2014-06-30 22:00:37
首先你是已经做成功的了，说明你这个肯定是可以做出来的。所以最简单的方法是你完全按照第一次做出来的条件去做。从你描述的来看，方法是没问题的。但你第二次PCR，有几个地方我不太理解：1）既然PCR没有P出来为什么 ...

谢谢楼上的回复，1）PCR当时没有P出来，我有考虑是不是P产物太弱，电泳看不到，也许是有东西的，就试着转化；2）引物第一次能成功出来的是减半的量，相当于稀释2倍；对应的质粒是稀释了10倍；之后做不出来的时候，我发现一直有引物二聚体，就试了将质粒稀释3倍或者5倍，引物稀释2倍、5倍和10倍，分别试，后面引物二聚体没有了，但仍然没有P产物。    此外，我将这个PCR后的东西，没有经过Dpn1消化，直接进行了转化，我想看看是否会长斑，不管有没有P产物，原始模板应该是有的，但结果发现仍不长斑（转化时做了对照，对照有长斑的）。3）质粒电泳的问题，这里我自己的质粒，超螺旋结构应该在7000bp，感觉应该是跑出超螺旋、线性和环状，三条带都有，但奇怪的是，还有10000bp以上的条带，我怀疑10000bp的是基因组DNA或者什么东西，是不是质粒不纯，但是我自己的也是有条带的，按道理也是应该能做出来的。  现在质粒也是重提的，引物稀释了大倍数后，引物二聚体也没有了，会不会引物又太少了，结合不上。请教请教，谢谢
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3楼2014-07-01 09:46:35
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xuanyalizi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2014-06-30 23:46:52
首先你是已经做成功的了，说明你这个肯定是可以做出来的。所以最简单的方法是你完全按照第一次做出来的条件去做。从你描述的来看，方法是没问题的。但你第二次PCR，有几个地方我不太理解：1）既然PCR没有P出来为什么还要去做转化，个人觉得有点自己骗自己了（不要介意），2）你所说的模板，引物稀释是跟你第一次的引物模板都一样吗?一般来说，PCR引物浓度是固定的（比如说10uM），质粒模板也是比如说10ng，20ng之类，至少有个大概。3）你质粒电泳看到有两条带，这与你第一次成功的时候是一样的吗？到底是质粒开环还是有别的质粒呢？再说就算有别的质粒，只要有需要的质粒应该也能P出来的。从你的描述我感觉你是质粒模板弄错了，引物很亮说明引物没有结合，肯定是没P出来。
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闲适恬淡，宠辱不惊
2楼2014-06-30 22:00:37
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