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lixin123qq

木虫 (小有名气)

小小博士

[求助] 关于膜蛋白表达纯化及结构解析的几个问题,求解答！ 已有3人参与

各位学长前辈你们好，我是天津工生所的学生，现在在做一个膜蛋白的表达纯化以及结构解析。由于经验不足，遇到各种问题，想请教下各位前辈~~
我们是采用大肠杆菌C43来对目的膜蛋白进行外源表达，我选择的是DDM来溶解细胞膜并提取膜蛋白（溶膜效果不错）。但是：
1. 在进行SDS-PAGE时，条带总是弥散状态（样品加入loading buffer后直接上样电泳，没有加热），用同样的loading buffer跑可溶蛋白，则没有弥散现象。这是什么原因呢？如何解决？弥散状态是否能说明蛋白以不均一状态存在？
2. 我们在得到纯度较好的蛋白后进行hampton screen 试剂盒筛选点晶，发现有很多条件下长出不很规则的圆球状颗粒，用捞晶环碰触，其质感不像晶体，有种“绵绵”的感觉，请问大家有遇到同样情况吗？这种颗粒是什么呢？是detergent？什么原因导致这种颗粒的形成呢？
3. 我手上还有另外一个膜蛋白，也是用DDM进行溶膜提取，Ni柱纯化后，4度放置一天则会发现其溶液呈烟雾状，这应该是蛋白不稳定导致的，遇到这种情况我该从哪些方面进行改善呢？
课题纠缠于这些问题不得进展，很是痛苦，希望各位前辈不吝赐教，不胜感激！

关于膜蛋白表达纯化及结构解析的几个问题,求解答！
膜蛋白SDS-PAGE.jpg


关于膜蛋白表达纯化及结构解析的几个问题,求解答！-1
球状颗粒.jpg
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1楼 2014-06-25 16:46:21
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乐乐lelele

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 1074799343 at 2016-01-08 20:05:46
我也在长膜蛋白晶体，很是痛苦。也遇见跟你一样的情况，那种圆的是DDM 聚集。不是蛋白晶体。这个我可以百分之百确定，我长了很多都是这样的。
如果想要缓解的话，需要用100KD的浓缩管浓缩，使DDM聚集相对能少一点。 ...

你好，我是蛋白纯化的新手小白，想问一下膜蛋白跑SDS-PAGE胶前，为什么不能加热上样？
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4楼2018-08-06 20:26:44
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wacx33

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-25 20:27:58
本帖内容被屏蔽
2楼2014-06-25 19:27:20
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1074799343

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也在长膜蛋白晶体，很是痛苦。也遇见跟你一样的情况，那种圆的是DDM 聚集。不是蛋白晶体。这个我可以百分之百确定，我长了很多都是这样的。
如果想要缓解的话，需要用100KD的浓缩管浓缩，使DDM聚集相对能少一点。但是蛋白也会减少，这是没办法的办法。
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3楼2016-01-08 20:05:46
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乐乐lelele

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by wacx33 at 2014-06-25 19:27:20
你那种晶体我以前也碰到过，不过我的是水溶性蛋白，我那时长的是白的那种圆状物，后来发现是盐晶。
关于蛋白会雾化，估计是不稳定，看看换换buffer能否增加稳定性，分装后直接冻存-80℃，再长晶体看看怎么样。
另 ...

你好，我是蛋白纯化的新手小白，想问一下膜蛋白跑SDS-PAGE胶前，为什么不能加热上样？
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5楼2018-08-06 21:00:47
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