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lixin123qq木虫 (小有名气)
小小博士
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[求助]
关于膜蛋白表达纯化及结构解析的几个问题,求解答！已有3人参与
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各位学长前辈你们好，我是天津工生所的学生，现在在做一个膜蛋白的表达纯化以及结构解析。由于经验不足，遇到各种问题，想请教下各位前辈~~ 我们是采用大肠杆菌C43来对目的膜蛋白进行外源表达，我选择的是DDM来溶解细胞膜并提取膜蛋白（溶膜效果不错）。但是： 1. 在进行SDS-PAGE时，条带总是弥散状态（样品加入loading buffer后直接上样电泳，没有加热），用同样的loading buffer跑可溶蛋白，则没有弥散现象。这是什么原因呢？如何解决？弥散状态是否能说明蛋白以不均一状态存在？ 2. 我们在得到纯度较好的蛋白后进行hampton screen 试剂盒筛选点晶，发现有很多条件下长出不很规则的圆球状颗粒，用捞晶环碰触，其质感不像晶体，有种“绵绵”的感觉，请问大家有遇到同样情况吗？这种颗粒是什么呢？是detergent？什么原因导致这种颗粒的形成呢？ 3. 我手上还有另外一个膜蛋白，也是用DDM进行溶膜提取，Ni柱纯化后，4度放置一天则会发现其溶液呈烟雾状，这应该是蛋白不稳定导致的，遇到这种情况我该从哪些方面进行改善呢？ 课题纠缠于这些问题不得进展，很是痛苦，希望各位前辈不吝赐教，不胜感激！  膜蛋白SDS-PAGE.jpg  球状颗粒.jpg |
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-25 20:27:58
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