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冰眉儿木虫 (著名写手)
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[求助]
Red重组PCR相关问题
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前期通过设计同源臂，以用pkD3中氯霉素片段替换目标基因（电泳结果、测序结果均以证明替换成功），导入pcp20质粒，通过调整温度，以实现氯霉素基因的脱除。平板验证时菌落在氯霉素板上是无法生长的，初步表明cm基因片段应该已经脱除了。但以原来的验证引物（验证氯霉素取代了目的基因所设计的引物，在目标基因上下游100 bp左右）进行PCR验证，换过很多种酶（Takara的ex-Taq，primer star，诺唯赞的mix）并且试过温度梯度，就是怎么也扩不出来片段。 氯霉素替换目标基因后片段大小在1200bp左右，这个和实验现象是符合的，后面氯霉素脱除之后，片段大小可能小于500。想请教下各位大侠，之前是否遇到过这种情况，是怎么解决的呢，谢谢！ |
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