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Red重组PCR相关问题
前期通过设计同源臂,以用pkD3中氯霉素片段替换目标基因(电泳结果、测序结果均以证明替换成功),导入pcp20质粒,通过调整温度,以实现氯霉素基因的脱除。平板验证时菌落在氯霉素板上是无法生长的,初步表明cm基因片段应该已经脱除了。但以原来的验证引物(验证氯霉素取代了目的基因所设计的引物,在目标基因上下游100 bp左右)进行PCR验证,换过很多种酶(Takara的ex-Taq,primer star,诺唯赞的mix)并且试过温度梯度,就是怎么也扩不出来片段。
氯霉素替换目标基因后片段大小在1200bp左右,这个和实验现象是符合的,后面氯霉素脱除之后,片段大小可能小于500。想请教下各位大侠,之前是否遇到过这种情况,是怎么解决的呢,谢谢! |
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