| 查看: 2574 | 回复: 2 | ||
[求助]
急急急，荧光定量PCR引物及扩增效率求助~~~~~~~~~~~~~~~~
|
|
这段时间一直在做定量PCR，是做室内纯菌培养的功能基因，所用的质粒是找测序公司 合成的，然后返回的大肠杆菌，我自己培养后用qiagen试剂盒提取的，DNA是纯菌提取RNA后反转录得到。然后一开始使用提取的质粒直接作为模板做标准曲线，所有的标曲基本上R2值都可以在0.997~1左右，然后有一个基因glk基因扩增效率还不错102%左右，后面连着标曲和样品一起做，扩增效率也差不多，另外两个基因soxb基因一个扩增效率一直在80%左右甚至60%多，另一个基因cbbl基因基本上稀释梯度第三个之后的梯度就扩不出来的，在做标曲之前有做了定量，三个基因的反转录得到的DNA浓度基本上差不多。 后面听大家说，那个是传统的方法，现在发文章好像是要求不能直接用环状质粒做标曲的模板，需要线性化，然后我根据一个师兄的建议，直接用载体引物PCR跑胶后进行胶回收来纯化的DNA，试剂盒也是qiagen的，结果这样得到的纯化后的DNA去做标曲，glk和soxb基因的标曲，R2值还是0.997~1左右，扩增效率却一直在80%~90%直接，勉强偶尔到91%、92%左右但却没有重复性，而且也有做退火温度梯度，从52~65℃左右，基本上都是80%多，没有明显的差，两个基因都做退火温度梯度了。也有把引物量提高，把体系中DNA的量也有该，各种都试了都不行，然后我做定量PCR的试剂盒是gotaq的试剂盒，里面的酶什么都是混合好的MIX，不知道应该下一步怎么继续了。另一个cbbl基因干脆扩增效率60%，怀疑是引物问题，重新又设计了3对引物，结果今天用这三对引物做温度梯度，溶解曲线都是乱的，不知道是引物二聚体太多还是什么。。。 已经是延期毕业了，实验还是没有进展，快要撑不住了！！！！！！！！！！求助~~~~~~~~~~~~~~~ 还有，有人做过cbbl、glk、soxb、zwf、edd、eda这些基因的荧光定量么，有没有比较好的引物推荐~~~~~~~~~~~~~~~ 谢谢！！！！！！！！！！！！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有71人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 荧光定量标准曲线问题！！急急急！在线等答案
已经有3人回复
- 你们的荧光定量检测引物扩增的标准曲线问题！求指教
已经有4人回复
- 荧光定量PCR引物设计
已经有8人回复
- 求助荧光定量PCR引物设计
已经有12人回复
- 荧光定量引物问题
已经有4人回复
- 荧光定量，怎么验证引物效率呢
已经有6人回复
- 关于荧光定量PCR引物设计的问题
已经有7人回复
- 求助荧光定量引物验证？
已经有3人回复
- 跪求帮忙设计个荧光定量PCR的引物
已经有6人回复
- 荧光定量扩增效率问题
已经有6人回复
- 荧光定量pcr,以及内参基因的选择。
已经有4人回复
- 求助荧光定量PCR统计方法
已经有7人回复
- 荧光定量PCR扩增效率低
已经有16人回复
- 关于实时荧光定量引物设计
已经有5人回复
- 荧光定量内参基因引物的设计
已经有6人回复
- 荧光定量引物设计
已经有4人回复
- 定量PCR扩增效率过高(SYBR)
已经有3人回复
- 求解：Taqman MGB实时荧光定量PCR空白对照组荧光信号很强怎么回事？
已经有10人回复
- 荧光定量PCR。。。求助求助
已经有17人回复
- 荧光定量扩增效率低怎么办
已经有3人回复
- PCR引物扩增的问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】实时荧光定量PCR的扩增效率低该如何改进？
已经有5人回复
- 【求助/交流】荧光定量PCR引物跨内含子的问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】荧光定量pcr
已经有11人回复
jifengyun321
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1147.8
- 散金: 570
- 红花: 3
- 帖子: 312
- 在线: 150.4小时
- 虫号: 3304811
- 注册: 2014-07-03
- 专业: 微生物生态学
2楼2014-08-22 16:11:08
3楼2015-07-04 16:36:08
20