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急急急，荧光定量PCR引物及扩增效率求助~~~~~~~~~~~~~~~~
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这段时间一直在做定量PCR，是做室内纯菌培养的功能基因，所用的质粒是找测序公司 合成的，然后返回的大肠杆菌，我自己培养后用qiagen试剂盒提取的，DNA是纯菌提取RNA后反转录得到。然后一开始使用提取的质粒直接作为模板做标准曲线，所有的标曲基本上R2值都可以在0.997~1左右，然后有一个基因glk基因扩增效率还不错102%左右，后面连着标曲和样品一起做，扩增效率也差不多，另外两个基因soxb基因一个扩增效率一直在80%左右甚至60%多，另一个基因cbbl基因基本上稀释梯度第三个之后的梯度就扩不出来的，在做标曲之前有做了定量，三个基因的反转录得到的DNA浓度基本上差不多。 后面听大家说，那个是传统的方法，现在发文章好像是要求不能直接用环状质粒做标曲的模板，需要线性化，然后我根据一个师兄的建议，直接用载体引物PCR跑胶后进行胶回收来纯化的DNA，试剂盒也是qiagen的，结果这样得到的纯化后的DNA去做标曲，glk和soxb基因的标曲，R2值还是0.997~1左右，扩增效率却一直在80%~90%直接，勉强偶尔到91%、92%左右但却没有重复性，而且也有做退火温度梯度，从52~65℃左右，基本上都是80%多，没有明显的差，两个基因都做退火温度梯度了。也有把引物量提高，把体系中DNA的量也有该，各种都试了都不行，然后我做定量PCR的试剂盒是gotaq的试剂盒，里面的酶什么都是混合好的MIX，不知道应该下一步怎么继续了。另一个cbbl基因干脆扩增效率60%，怀疑是引物问题，重新又设计了3对引物，结果今天用这三对引物做温度梯度，溶解曲线都是乱的，不知道是引物二聚体太多还是什么。。。 已经是延期毕业了，实验还是没有进展，快要撑不住了！！！！！！！！！！求助~~~~~~~~~~~~~~~ 还有，有人做过cbbl、glk、soxb、zwf、edd、eda这些基因的荧光定量么，有没有比较好的引物推荐~~~~~~~~~~~~~~~ 谢谢！！！！！！！！！！！！！！ |
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jifengyun321
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