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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教
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雪域尘影

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教 已有1人参与

各位前辈好，我是用takara的试剂盒做相对定量PCR，SYBR法，采用20ul体系，试剂盒推荐的引物浓度0.2μM，内参用的β-actin，然后发现我的目的基因CT值太大了，差不多30，不好往下稀释作标曲；我就把引物浓度调到了0.5μM,CT值降低了一点。但是溶解曲线主峰前面都有一个鼓起的小包包，请问这样的溶解曲线合格吗？师姐说我的溶解曲线太丑了,如果不行的话，我应该怎么调整试验呢？

荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教
Melt Curve-β-0.5uM.jpg


荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教-1
Melt Curve-n-0.2uM.jpg


荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教-2
Melt Curve-n-0.5uM.jpg


荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教-3
Melt Curve-r-0.2uM.jpg


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Melt Curve-r-0.5uM.jpg


荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教-5
Melt Curve-β-0.2uM.jpg
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1楼 2014-06-12 18:30:54
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胖墩儿Adolph

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
雪域尘影: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2014-06-14 19:16:05
是不是引物二聚体？
赞一下 回复此楼
我不爱上课，但很爱学习！
2楼2014-06-13 15:27:46
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雪域尘影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 胖墩儿Adolph at 2014-06-13 15:27:46
是不是引物二聚体？

多谢你的指教。做了阴性对照，0.5uM引物，溶解曲线中前面的小包包趋势和实验组一致，这样是不是就是二聚体引起的呢？但是0.2uM的时候就已经有鼓起来的部分了，引物浓度已经是试剂盒推荐的最低浓度了，不知道接下来该怎么调整，试着调过cDNA的量，但没什么作用。我初次做PCR，很多都不懂
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3楼2014-06-14 19:14:30
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