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雪域尘影

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教 已有1人参与

各位前辈好,我是用takara的试剂盒做相对定量PCR,SYBR法,采用20ul体系,试剂盒推荐的引物浓度0.2μM,内参用的β-actin,然后发现我的目的基因CT值太大了,差不多30,不好往下稀释作标曲;我就把引物浓度调到了0.5μM,CT值降低了一点。但是溶解曲线主峰前面都有一个鼓起的小包包,请问这样的溶解曲线合格吗?师姐说我的溶解曲线太丑了,如果不行的话,我应该怎么调整试验呢?

荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教
Melt Curve-β-0.5uM.jpg


荧光定量PCR溶解曲线问题-新手求教-1
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胖墩儿Adolph

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
雪域尘影: 金币+5, 有帮助, 谢谢 2014-06-14 19:16:05
是不是引物二聚体?
我不爱上课,但很爱学习!
2楼2014-06-13 15:27:46
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雪域尘影

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 胖墩儿Adolph at 2014-06-13 15:27:46
是不是引物二聚体?

多谢你的指教。做了阴性对照,0.5uM引物,溶解曲线中前面的小包包趋势和实验组一致,这样是不是就是二聚体引起的呢?但是0.2uM的时候就已经有鼓起来的部分了,引物浓度已经是试剂盒推荐的最低浓度了,不知道接下来该怎么调整,试着调过cDNA的量,但没什么作用。我初次做PCR,很多都不懂
3楼2014-06-14 19:14:30
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