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鸦米

新虫 (小有名气)

[交流] 有人在做BiFC吗？已有16人参与

因为我近期要做BiFC,我们实验室之前没有人做过，所以想请教曾经做过的朋友一些问题，哪位做过可以交流一下吗？
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1楼2014-06-04 11:54:13
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starseacow

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:09:27
我主要在拟南芥和烟草上做，实验室里也有人做原生质体，没什么特别要注意的，按照合适正确的protocol做就可以。做bifc，还是要尽可能避免背景干扰和假阳性结果。
我希望你把问题列出来而不是私下交流，是为了给其他虫友一些可参考的信息。

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5楼2014-06-05 15:08:29
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starseacow

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8楼: Originally posted by beimi at 2014-06-05 18:59:34
你好，请问你是利用什么方法避免背景干扰的，因为我最近做的阴性对照也有荧光信号，不知道如何确认结果。谢谢啦...

请参考我上面给出的回复，另外，对confocal进行比较好的设置也很重要。

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11楼2014-06-07 02:36:20
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泡菜肉丝

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7楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-05 17:09:05
您好，我想咨询下你手上的BIFC系统的阴性对照和阳性对照在正常转染情况下是否都存在荧光情况，另外您用来最后肯定两者存在相互作用是否是根据荧光蛋白的比例来衡量的还是其他的方法？之前做这方面的实验一直不是很 ...

你好，我最近在做BiFC，阴性对照也有荧光，而且很亮很多，我得阴性对照是两个空载体，请问这种情况你是怎么解决的，希望能帮我解答一下，谢谢
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qingfeng2011
33楼2014-08-16 13:34:12
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泡菜肉丝

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8楼: Originally posted by beimi at 2014-06-05 18:59:34
你好，请问你是利用什么方法避免背景干扰的，因为我最近做的阴性对照也有荧光信号，不知道如何确认结果。谢谢啦...

你好，我最近在做BiFC，阴性对照也有荧光，而且很亮很多，我得阴性对照是两个空载体，请问这种情况你是怎么解决的，希望能帮我解答一下，谢谢
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34楼2014-08-16 13:34:31
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泡菜肉丝

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40楼: Originally posted by beimi at 2014-08-17 21:04:58
重新做，可能是污染
...

污染？你的意思是治理污染了？我们做了两次，空载体对照都会发光，很亮。请问你们做的也是空载体对照吗？
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41楼2014-08-18 16:22:25
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qingfeng2011

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33楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-16 13:34:12
你好，我最近在做BiFC，阴性对照也有荧光，而且很亮很多，我得阴性对照是两个空载体，请问这种情况你是怎么解决的，希望能帮我解答一下，谢谢...

请问楼主，BiFC，阴性对照也有荧光，而且很亮很多的问题是怎么解决的呢？
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46楼2016-01-05 17:00:57
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qingfeng2011

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35楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-16 13:39:08
你好，我的也是同样的问题，而且我得阴性对照（两个空载体）远远比我的实验组荧光强得多，理论上两个空载体的荧光蛋白碰撞几率小于互作的呀，怎么回事？...

请问楼主，bifc阴性对照远远比实验组荧光强得多的问题是怎么解决的呢？
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47楼2016-01-05 17:02:12
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starseacow

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我在做，有什么问题请详细列出来
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鸦米
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2楼2014-06-04 16:43:30
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鸦米

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2楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-04 16:43:30
我在做，有什么问题请详细列出来

可以留下QQ吗？我刚开始做，实验室也没有人做过，可能问题会比较多
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3楼2014-06-05 08:23:55
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鸦米

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2楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-04 16:43:30
我在做，有什么问题请详细列出来

要是不方便的化我先问几个问题吧，你们是转的拟南芥原生质体吗？操作上有什么需要注意的吗？
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4楼2014-06-05 08:25:54
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鸦米

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5楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-05 15:08:29
我主要在拟南芥和烟草上做，实验室里也有人做原生质体，没什么特别要注意的，按照合适正确的protocol做就可以。做bifc，还是要尽可能避免背景干扰和假阳性结果。
我希望你把问题列出来而不是私下交流，是为了给其他 ...

好的，先谢谢啦，那您有potocol吗？因为我们实验室的载体是跟别人借的，一些基础资料都没有
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6楼2014-06-05 16:41:03
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-05 15:08:29
我主要在拟南芥和烟草上做，实验室里也有人做原生质体，没什么特别要注意的，按照合适正确的protocol做就可以。做bifc，还是要尽可能避免背景干扰和假阳性结果。
我希望你把问题列出来而不是私下交流，是为了给其他 ...

您好，我想咨询下你手上的BIFC系统的阴性对照和阳性对照在正常转染情况下是否都存在荧光情况，另外您用来最后肯定两者存在相互作用是否是根据荧光蛋白的比例来衡量的还是其他的方法？之前做这方面的实验一直不是很顺利，希望能够有所学习，谢谢了
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7楼2014-06-05 17:09:05
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beimi

木虫 (著名写手)
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5楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-05 15:08:29
我主要在拟南芥和烟草上做，实验室里也有人做原生质体，没什么特别要注意的，按照合适正确的protocol做就可以。做bifc，还是要尽可能避免背景干扰和假阳性结果。
我希望你把问题列出来而不是私下交流，是为了给其他 ...

你好，请问你是利用什么方法避免背景干扰的，因为我最近做的阴性对照也有荧光信号，不知道如何确认结果。谢谢啦
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6楼: Originally posted by 鸦米 at 2014-06-05 16:41:03
好的，先谢谢啦，那您有potocol吗？因为我们实验室的载体是跟别人借的，一些基础资料都没有...

我们组有自己做的载体，具体做法可以参考这篇文章
Grefen C, Blatt M Biotechnology 2012,53(5):311~314
另外，也可以参考
Karnik R et al. Plant Cell 2013,25(4):1368

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9楼2014-06-07 02:27:04
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西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:10:13
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7楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-05 17:09:05
您好，我想咨询下你手上的BIFC系统的阴性对照和阳性对照在正常转染情况下是否都存在荧光情况，另外您用来最后肯定两者存在相互作用是否是根据荧光蛋白的比例来衡量的还是其他的方法？之前做这方面的实验一直不是很 ...

有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／RFP比值表示结果，同时，添加一定的tag以便做western检查表达水平。结合这些手段，可以有效抑制干扰并获得可信结果。具体可以参考上面列出的文章。

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