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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 有人在做BiFC吗？
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starseacow

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19楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-07 19:08:22
的确我的蛋白比较大，1700多个aa，荧光强度比较低，我想过可能有两个原因：
1. 荧光蛋白的N和C端，接上目的蛋白，目的蛋白影响了荧光蛋白正确构象的形成，导致互补后荧光强度低

2. 荧光蛋白的N或者C端能够形成 ...

试试用不同的BIFC载体，分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响，我感觉荧光蛋白没那么大，不用太担心，很可能影响还是你说的第二条。另外，你用的载体上启动子是什么？
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21楼2014-06-08 06:03:46
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gyesang

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:27:17
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21楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 06:03:46
试试用不同的BIFC载体，分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响，我感觉荧光蛋白没那么大，不用太担心，很可能影响还是你说的第二条。另外，你用的载体上启动子是什么？...

试试用不同的BIFC载体，什么意思，表达出来的不还是原来的融合蛋白吗，我是在哺乳动物细胞里面做的，用的是CMV启动子
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22楼2014-06-08 11:17:48
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starseacow

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22楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 11:17:48
试试用不同的BIFC载体，什么意思，表达出来的不还是原来的融合蛋白吗，我是在哺乳动物细胞里面做的，用的是CMV启动子...

我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体
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23楼2014-06-08 16:16:42
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gyesang

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23楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 16:16:42
我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体...

基本8种组合都有试过的，就是不亮，不知道再如何做优化，有一个蛋白1700aa，不知道蛋白是不是有点大了
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24楼2014-06-08 17:54:11
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starseacow

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24楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 17:54:11
基本8种组合都有试过的，就是不亮，不知道再如何做优化，有一个蛋白1700aa，不知道蛋白是不是有点大了...

在前面的帖子里看成bp了，如果是1700aa的话，确实很大。我不懂动物方面的研究，是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法？
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25楼2014-06-09 05:13:15
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sarah-miao

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10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／ ...

好的，学习了，谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么
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26楼2014-06-09 08:53:48
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／ ...

方便把文章分享一下么？
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27楼2014-06-09 08:54:39
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gyesang

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25楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-09 05:13:15
在前面的帖子里看成bp了，如果是1700aa的话，确实很大。我不懂动物方面的研究，是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法？...

看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章，外源表达量与内源的表达量相当的话比较好，如果外源的表达量过大的话，会不会产生背景？
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28楼2014-06-09 10:36:12
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starseacow

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26楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-09 08:53:48
好的，学习了，谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么...

在前面的帖子里我已经列出了相关文章
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29楼2014-06-09 16:10:41
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28楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-09 10:36:12
看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章，外源表达量与内源的表达量相当的话比较好，如果外源的表达量过大的话，会不会产生背景？...

我觉得多少会有一定干扰，但程度如何，恐怕得具体问题具体分析
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30楼2014-06-09 16:11:42
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