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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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starseacow

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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19楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-07 19:08:22
的确我的蛋白比较大,1700多个aa,荧光强度比较低,我想过可能有两个原因:
1. 荧光蛋白的N和C端,接上目的蛋白,目的蛋白影响了荧光蛋白正确构象的形成,导致互补后荧光强度低

2. 荧光蛋白的N或者C端能够形成 ...

试试用不同的BIFC载体,分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响,我感觉荧光蛋白没那么大,不用太担心,很可能影响还是你说的第二条。另外,你用的载体上启动子是什么?
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21楼2014-06-08 06:03:46
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gyesang

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:27:17
引用回帖:
21楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 06:03:46
试试用不同的BIFC载体,分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响,我感觉荧光蛋白没那么大,不用太担心,很可能影响还是你说的第二条。另外,你用的载体上启动子是什么?...

试试用不同的BIFC载体,什么意思,表达出来的不还是原来的融合蛋白吗,我是在哺乳动物细胞里面做的,用的是CMV启动子
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
22楼2014-06-08 11:17:48
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starseacow

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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22楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 11:17:48
试试用不同的BIFC载体,什么意思,表达出来的不还是原来的融合蛋白吗,我是在哺乳动物细胞里面做的,用的是CMV启动子...

我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体
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23楼2014-06-08 16:16:42
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gyesang

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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23楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 16:16:42
我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体...

基本8种组合都有试过的,就是不亮,不知道再如何做优化,有一个蛋白1700aa,不知道蛋白是不是有点大了
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24楼2014-06-08 17:54:11
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starseacow

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 17:54:11
基本8种组合都有试过的,就是不亮,不知道再如何做优化,有一个蛋白1700aa,不知道蛋白是不是有点大了...

在前面的帖子里看成bp了,如果是1700aa的话,确实很大。我不懂动物方面的研究,是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法?
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25楼2014-06-09 05:13:15
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sarah-miao

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常,有时候尤其是做拟南芥根,什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统,在载体上单独加上了一个RFP,这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果,并用YFP/ ...

好的,学习了,谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么
26楼2014-06-09 08:53:48
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常,有时候尤其是做拟南芥根,什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统,在载体上单独加上了一个RFP,这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果,并用YFP/ ...

方便把文章分享一下么?
27楼2014-06-09 08:54:39
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gyesang

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
25楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-09 05:13:15
在前面的帖子里看成bp了,如果是1700aa的话,确实很大。我不懂动物方面的研究,是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法?...

看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章,外源表达量与内源的表达量相当的话比较好,如果外源的表达量过大的话,会不会产生背景?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
28楼2014-06-09 10:36:12
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starseacow

专家顾问 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-09 08:53:48
好的,学习了,谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么...

在前面的帖子里我已经列出了相关文章
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29楼2014-06-09 16:10:41
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starseacow

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引用回帖:
28楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-09 10:36:12
看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章,外源表达量与内源的表达量相当的话比较好,如果外源的表达量过大的话,会不会产生背景?...

我觉得多少会有一定干扰,但程度如何,恐怕得具体问题具体分析
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30楼2014-06-09 16:11:42
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