19楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-07 19:08:22
的确我的蛋白比较大，1700多个aa，荧光强度比较低，我想过可能有两个原因：
1. 荧光蛋白的N和C端，接上目的蛋白，目的蛋白影响了荧光蛋白正确构象的形成，导致互补后荧光强度低

2. 荧光蛋白的N或者C端能够形成 ...

21楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 06:03:46
试试用不同的BIFC载体，分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响，我感觉荧光蛋白没那么大，不用太担心，很可能影响还是你说的第二条。另外，你用的载体上启动子是什么？...

22楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 11:17:48
试试用不同的BIFC载体，什么意思，表达出来的不还是原来的融合蛋白吗，我是在哺乳动物细胞里面做的，用的是CMV启动子...

23楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 16:16:42
我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体...

24楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 17:54:11
基本8种组合都有试过的，就是不亮，不知道再如何做优化，有一个蛋白1700aa，不知道蛋白是不是有点大了...

10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／ ...

10楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 02:34:43
有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／ ...

25楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-09 05:13:15
在前面的帖子里看成bp了，如果是1700aa的话，确实很大。我不懂动物方面的研究，是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法？...

26楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-09 08:53:48
好的，学习了，谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么...

28楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-09 10:36:12
看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章，外源表达量与内源的表达量相当的话比较好，如果外源的表达量过大的话，会不会产生背景？...