应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 有人在做BiFC吗？
161/2返回列表12下一页
查看: 7595  |  回复: 52
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

鸦米

新虫 (小有名气)

[交流] 有人在做BiFC吗？ 已有16人参与

因为我近期要做BiFC,我们实验室之前没有人做过，所以想请教曾经做过的朋友一些问题，哪位做过可以交流一下吗？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-04 11:54:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我在做，有什么问题请详细列出来
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

鸦米
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2014-06-04 16:43:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:09:27
我主要在拟南芥和烟草上做，实验室里也有人做原生质体，没什么特别要注意的，按照合适正确的protocol做就可以。做bifc，还是要尽可能避免背景干扰和假阳性结果。
我希望你把问题列出来而不是私下交流，是为了给其他虫友一些可参考的信息。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(3人) 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
5楼2014-06-05 15:08:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 鸦米 at 2014-06-05 16:41:03
好的，先谢谢啦，那您有potocol吗？因为我们实验室的载体是跟别人借的，一些基础资料都没有...

我们组有自己做的载体，具体做法可以参考这篇文章
Grefen C, Blatt M Biotechnology 2012,53(5):311~314
另外，也可以参考
Karnik R et al. Plant Cell 2013,25(4):1368

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
9楼2014-06-07 02:27:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:10:13
引用回帖:
7楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-05 17:09:05
您好，我想咨询下你手上的BIFC系统的阴性对照和阳性对照在正常转染情况下是否都存在荧光情况，另外您用来最后肯定两者存在相互作用是否是根据荧光蛋白的比例来衡量的还是其他的方法？之前做这方面的实验一直不是很 ...

有背景荧光干扰很正常，有时候尤其是做拟南芥根，什么都不赚转植物本身也有一定的荧光信号。我们的做法是建立了一个rBiFC系统，在载体上单独加上了一个RFP，这样可以依靠RFP信号检查农杆菌侵染转化效果，并用YFP／RFP比值表示结果，同时，添加一定的tag以便做western检查表达水平。结合这些手段，可以有效抑制干扰并获得可信结果。具体可以参考上面列出的文章。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
10楼2014-06-07 02:34:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by beimi at 2014-06-05 18:59:34
你好，请问你是利用什么方法避免背景干扰的，因为我最近做的阴性对照也有荧光信号，不知道如何确认结果。谢谢啦...

请参考我上面给出的回复，另外，对confocal进行比较好的设置也很重要。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
11楼2014-06-07 02:36:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-07 11:57:06
我做的A蛋白和B蛋白确定有相互作用，但是用BiFc互补后，荧光很弱，你觉得会有什么可能的原因？...

蛋白丰度不够可能是一个原因，另外，我觉得也可以考虑你究竟把荧光蛋白连接在目的蛋白的N端还是C端，这有时候也会影响荧光信号强度
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
17楼2014-06-07 18:17:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-07 19:08:22
的确我的蛋白比较大，1700多个aa，荧光强度比较低，我想过可能有两个原因：
1. 荧光蛋白的N和C端，接上目的蛋白，目的蛋白影响了荧光蛋白正确构象的形成，导致互补后荧光强度低

2. 荧光蛋白的N或者C端能够形成 ...

试试用不同的BIFC载体，分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响，我感觉荧光蛋白没那么大，不用太担心，很可能影响还是你说的第二条。另外，你用的载体上启动子是什么？
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
21楼2014-06-08 06:03:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
22楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 11:17:48
试试用不同的BIFC载体，什么意思，表达出来的不还是原来的融合蛋白吗，我是在哺乳动物细胞里面做的，用的是CMV启动子...

我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
23楼2014-06-08 16:16:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by gyesang at 2014-06-08 17:54:11
基本8种组合都有试过的，就是不亮，不知道再如何做优化，有一个蛋白1700aa，不知道蛋白是不是有点大了...

在前面的帖子里看成bp了，如果是1700aa的话，确实很大。我不懂动物方面的研究，是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法？
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
25楼2014-06-09 05:13:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-06-09 08:53:48
好的，学习了，谢谢~~不过有一点还想请教下YFP以及YFP/RFP的检测是依靠什么系统以及检测的具体方法百度能够找到的么...

在前面的帖子里我已经列出了相关文章
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
29楼2014-06-09 16:10:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 鸦米 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭