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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 做过基因枪的请来交流下！
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绿草如茵

木虫 (小有名气)

[交流] 做过基因枪的请来交流下！

大家好，本人最近准备做洋葱表皮的亚定位，用基因枪做，请问谁做过啊？表达成功率如何啊？谢谢交流，我是小菜！谢谢你的参与！
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绿草如茵

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1楼 2012-03-14 18:01:07
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TYHJHL

铁杆木虫 (正式写手)
★
绿草如茵(金币+1): 谢谢参与
怎么没人回答呢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-03-14 20:08:31
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
如果克隆做的没有问题的话，可能多做几次就会出来的。毕竟刚开始做的时候，各种细节和操作把握的不好，另外这种瞬时表达不可靠。
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3楼2012-03-14 20:33:11
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我爱沈泉

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
只见过仪器，从来没用过，楼主你们好有钱啊。。。。
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4楼2012-03-15 09:40:40
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zdmei

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还好，这个实验比较容易，成功率挺高的呀。你先查些文献或问下做过的人，看看用哪种金粉、可裂膜等等参数，质粒用试剂盒多提点，初次做可设个梯度，洋葱要买新鲜的大个的...
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5楼2012-03-16 09:34:19
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒浓度很关键！至少0.5ug/ul以上，最好是1，每片洋葱最多轰3枪。祝好运！
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6楼2012-03-16 17:37:33
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-16 17:37:33:
质粒浓度很关键！至少0.5ug/ul以上，最好是1，每片洋葱最多轰3枪。祝好运！

质粒浓度不管，只要总量保持1ug不可以吗？因为不管浓度多少，最后不都是洗脱的时候去掉水了吗？最终不都是溶于酒精吗？而且轰击时，酒精都挥发掉了啊？？？不懂，求解！谢谢！
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7楼2012-03-16 21:53:43
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shaquila

金虫 (正式写手)
记住用confocus来看
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8楼2012-03-17 00:24:41
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-03-14 20:33:11:
如果克隆做的没有问题的话，可能多做几次就会出来的。毕竟刚开始做的时候，各种细节和操作把握的不好，另外这种瞬时表达不可靠。

"另外这种瞬时表达不可靠。"你这么说，是不是你有什么证据啊，求解，谢谢！
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9楼2012-03-17 17:33:13
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-16 17:37:33:
质粒浓度很关键！至少0.5ug/ul以上，最好是1，每片洋葱最多轰3枪。祝好运！

就是贴在一个板上的洋葱表皮可以连续轰几枪吗？我还不知道这个呢，谢谢了！
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10楼2012-03-17 17:34:30
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-17 00:24:41:
记住用confocus来看

谢谢!
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11楼2012-03-17 17:37:14
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-16 17:37:33:
质粒浓度很关键！至少0.5ug/ul以上，最好是1，每片洋葱最多轰3枪。祝好运！

你好，请问放在同一平板上的洋葱表皮还能轰两枪啊？我上次的只轰了一枪，效率不高，正愁呢！要是一个表皮能连续轰两枪并提高效率就好了啊！
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12楼2012-03-17 22:54:27
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-17 22:54:27:
你好，请问放在同一平板上的洋葱表皮还能轰两枪啊？我上次的只轰了一枪，效率不高，正愁呢！要是一个表皮能连续轰两枪并提高效率就好了啊！

轰两枪是肯定没问题的！如果效率不高，还是要多注意一下调整轰击距离，未开封的无水乙醇，防止子弹结块，以及高的质粒浓度。这个实验很容易的，我的BIFC有的都可以看到成片发光的细胞！
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13楼2012-03-20 16:16:43
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-16 21:53:43:
质粒浓度不管，只要总量保持1ug不可以吗？因为不管浓度多少，最后不都是洗脱的时候去掉水了吗？最终不都是溶于酒精吗？而且轰击时，酒精都挥发掉了啊？？？不懂，求解！谢谢！

质粒浓度很关键！亚精胺和氯化钙只是起辅助作用！最后洗脱的时候是去掉水了，但是如果浓度不高，结合在子弹上的DNA浓度就会降低，转化效率也会随之降低！
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14楼2012-03-20 16:21:50
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-17 00:24:41:
记住用confocus来看

是啊！不过看定位在哪里，一般像定位细胞核，只需要做个核染色，再对照试验结果即可！如果真要用共聚焦，还是建议转化原生质体，拟南芥、烟草这些的原生质体很好提取，而且如果是像1302这种载体，可以直接农杆菌注射，直接观察叶子来定位！
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15楼2012-03-20 16:26:29
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-17 17:34:30:
就是贴在一个板上的洋葱表皮可以连续轰几枪吗？我还不知道这个呢，谢谢了！

切块4*4cm大小，轰击的时候不要撕下洋葱表皮，因为后面还要培养，观察的时候根据轰击的范围再撕下表皮观察！
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16楼2012-03-20 16:30:15
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-20 16:16:43:
轰两枪是肯定没问题的！如果效率不高，还是要多注意一下调整轰击距离，未开封的无水乙醇，防止子弹结块，以及高的质粒浓度。这个实验很容易的，我的BIFC有的都可以看到成片发光的细胞！

你好，非常感谢你的热心帮助，请问为什么要用未开封的无水乙醇啊？谢谢解答！
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17楼2012-03-20 23:55:59
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-20 16:30:15:
切块4*4cm大小，轰击的时候不要撕下洋葱表皮，因为后面还要培养，观察的时候根据轰击的范围再撕下表皮观察！

？？？？我是先撕下表皮贴在MS+山梨醇培养基上后轰击的，可以吗？谢谢你了！
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18楼2012-03-20 23:57:58
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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17楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-20 23:55:59:
你好，非常感谢你的热心帮助，请问为什么要用未开封的无水乙醇啊？谢谢解答！

防止子弹结块，如果结块，基本就没有用了！
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19楼2012-03-21 03:34:06
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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18楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-20 23:57:58:
？？？？我是先撕下表皮贴在MS+山梨醇培养基上后轰击的，可以吗？谢谢你了！

这是谁出的馊主意啊，用高渗培养基还把表皮撕下来之后才轰击。高渗培养基目的就是培养后方便撕表皮。你这种我没试过，但是我敢肯定把表皮细胞撕下来培养肯定没有整个组织培养活性高。另外如果有尖头镊子，也就是那种医用的镊子，撕表皮会非常方便，就没必要高渗培养基了，随便什么配方的MS就可以了。
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20楼2012-03-21 03:45:00
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-21 03:45:00:
这是谁出的馊主意啊，用高渗培养基还把表皮撕下来之后才轰击。高渗培养基目的就是培养后方便撕表皮。你这种我没试过，但是我敢肯定把表皮细胞撕下来培养肯定没有整个组织培养活性高。另外如果有尖头镊子，也就是 ...

你好，不好意思，又要打扰你了，我还有问题请教你！就是质粒浓度是1ug/uL的话，你一般一个子弹用几个ug？还有你说的洋葱表皮不要撕下来，是不是把整片4*4的洋葱（就是鳞茎片，含洋葱肉和内表皮的鳞茎片）放在什么培养基上培养啊？你是放在什么培养基上培养的啊？谢谢，不胜感激！
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21楼2012-03-21 20:18:37
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
谢谢你的帮助!不胜感激！
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22楼2012-03-21 23:07:38
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
21楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-21 20:18:37:
你好，不好意思，又要打扰你了，我还有问题请教你！就是质粒浓度是1ug/uL的话，你一般一个子弹用几个ug？还有你说的洋葱表皮不要撕下来，是不是把整片4*4的洋葱（就是鳞茎片，含洋葱肉和内表皮的鳞茎片）放在什么 ...

对，就用你说的那个鳞茎片，内表皮朝上（也就是基因枪轰过的地方），直接放在MS培养基上就可以了，普通的MS培养基就可以。50ul（3mg）钨粉加入5-10ul质粒，打六枪！平均一个子弹1ug
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23楼2012-03-23 09:22:28
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-23 09:22:28:
对，就用你说的那个鳞茎片，内表皮朝上（也就是基因枪轰过的地方），直接放在MS培养基上就可以了，普通的MS培养基就可以。50ul（3mg）钨粉加入5-10ul质粒，打六枪！平均一个子弹1ug

你好，还得麻烦你，请教你问题啊，就是酒精用国产的的未开封的可以吗？一块鳞茎只轰击一枪可以吗？必须多轰几枪吗？谢谢，不胜感激！
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24楼2012-03-23 11:35:18
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gaolef4s

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-03-23 11:35:18:
你好，还得麻烦你，请教你问题啊，就是酒精用国产的的未开封的可以吗？一块鳞茎只轰击一枪可以吗？必须多轰几枪吗？谢谢，不胜感激！

我们都用国产分析纯，调整好轰击距离了，轰一枪是没问题的！
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25楼2012-03-24 07:18:28
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沙漠落日

金虫 (初入文坛)
★
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20楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-21 03:45:00
这是谁出的馊主意啊，用高渗培养基还把表皮撕下来之后才轰击。高渗培养基目的就是培养后方便撕表皮。你这种我没试过，但是我敢肯定把表皮细胞撕下来培养肯定没有整个组织培养活性高。另外如果有尖头镊子，也就是那 ...

打扰依稀啊，如果用农杆菌侵染做瞬时表达，表皮是撕下来放MS培养还是整各组织放到高渗培养基上好？
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26楼2014-07-14 09:20:51
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
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26楼: Originally posted by 沙漠落日 at 2014-07-14 09:20:51
打扰依稀啊，如果用农杆菌侵染做瞬时表达，表皮是撕下来放MS培养还是整各组织放到高渗培养基上好？...

不清楚!
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27楼2014-07-15 08:58:28
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小杨博士

新虫 (初入文坛)
★
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你好，我是做叶绿体转化的，需要用基因枪，请问你的基因枪是在哪里用的？
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28楼2016-03-18 16:21:56
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pengqian1210

新虫 (初入文坛)
★
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23楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-23 09:22:28
对，就用你说的那个鳞茎片，内表皮朝上（也就是基因枪轰过的地方），直接放在MS培养基上就可以了，普通的MS培养基就可以。50ul（3mg）钨粉加入5-10ul质粒，打六枪！平均一个子弹1ug...

您好，打扰一下，我是做基因枪的新手。洋葱培养这一块我还是没看明白，请问是先把整片4*4的洋葱（就是鳞茎片，含洋葱肉和内表皮的鳞茎片）内表面朝上放在普通MS培养基上培养4h，再把将金粉轰击后的洋葱继续培养（22℃培养24h），再用confocus观察时将内表皮撕下来？还有一个问题就是切下来的洋葱都有曲面，并不能完全接触MS培养基，这个有影响吗
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29楼2016-07-20 20:53:25
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wang_211

新虫 (小有名气)
★
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13楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-20 16:16:43
轰两枪是肯定没问题的！如果效率不高，还是要多注意一下调整轰击距离，未开封的无水乙醇，防止子弹结块，以及高的质粒浓度。这个实验很容易的，我的BIFC有的都可以看到成片发光的细胞！...

你好，我现在也在做基因枪轰击洋葱表皮，但是我有三个基因应该定位于不同位置，做出来却都定位在细胞核，这是为什么啊？我的质粒后来鉴定过了，没有搞混。
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30楼2016-08-27 10:39:30
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lilylanmei

新虫 (初入文坛)
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19楼: Originally posted by gaolef4s at 2012-03-21 03:34:06
防止子弹结块，如果结块，基本就没有用了！...

请问如何才能够不结块呢？我新开始做基因枪，我DNA包埋的体系是DNA2ug/ul加5ul，金颗粒30mg/ml加100ul，0.88M亚精胺加5ul，2.5MCaCl2加100ul，打6枪，总是结块，请问如何改善才能不结块呢？
使用不使用新开封的无水乙醇的影响非常大么？
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31楼2017-01-20 10:45:12
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
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31楼: Originally posted by lilylanmei at 2017-01-20 10:45:12
请问如何才能够不结块呢？我新开始做基因枪，我DNA包埋的体系是DNA2ug/ul加5ul，金颗粒30mg/ml加100ul，0.88M亚精胺加5ul，2.5MCaCl2加100ul，打6枪，总是结块，请问如何改善才能不结块呢？
使用不使用新开封的无 ...

你找几篇南京农业大学做大豆的SCI看看，做这个很多的，文献里的参数是能够做处出来的，具体怎么做的我也忘记了，不好意思。
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32楼2017-04-22 19:01:04
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