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如何提高拟南芥原生质体转化的效率 已有1人参与
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最近做拟南芥原生质体转化，用的两个质粒（一个红色荧光，一个绿色荧光）来转化。效率很低，也有很多破裂。想请教各位： 1. 质粒提取的方法是Tape-Arabidopsis Sandwich，但是试剂配制等又有参考了J Sheen方法的。应该差别不大的吧。叶片状态不稳定，这个可能是关键，用的是弱光下的叶片，长得非常慢，起码要6周才能长到J Sheen说的四周大小。不知道这个影响大不大。 2. 转化后是放在光下的，16-24h都试过了，效率都没有很高。到底是在光下好还是黑暗呢，时间多久合适呢？ 3. 在激光共聚焦观察之前，转化体系都一直保持在六孔板里面，但是这样去检测的时候浓度就太稀了，找细胞都要找好久，不知道能不能离心一下放管子里？这样会不会导致细胞破裂啊？ 4. 我们的激光共聚焦是倒置的，我都盖盖玻片了，这个过程不会把细胞压破吧？我在观察的时候会看到有些细胞慢慢的在变形，刚看的时候还是圆的，很完整很漂亮，等到拍照完了叶绿体等都跑到一边去了，这是什么原因造成的呢，有办法解决吗？ |
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 生物科学 |
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七八月的阳光: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-30 16:36:18
七八月的阳光: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-30 16:36:18
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根据我的经验，逐条回答如下： 1. 质粒提取的方法是Tape-Arabidopsis Sandwich，但是试剂配制等又有参考了J Sheen方法的。应该差别不大的吧。叶片状态不稳定，这个可能是关键，用的是弱光下的叶片，长得非常慢，起码要6周才能长到J Sheen说的四周大小。不知道这个影响大不大。 P：质粒提取可以考虑去内毒素，这个方法和试剂盒比较多。叶片状态不稳定，这个是原生质体游离，我们有充分经验告诉这个很关键，建议生长在12h12h的环境下，适当遮光，叶片状态尽量接近J Sheen视频上的样子。叶片状态不好，原生质体破碎会严重，叶绿体也会明显靠向一边。 2. 转化后是放在光下的，16-24h都试过了，效率都没有很高。到底是在光下好还是黑暗呢，时间多久合适呢？ P：我们一般过夜暗转化，12-16h，时间长可能未必效率就很高。还有转化效率不高会不会给你使用的质粒有关。 3. 在激光共聚焦观察之前，转化体系都一直保持在六孔板里面，但是这样去检测的时候浓度就太稀了，找细胞都要找好久，不知道能不能离心一下放管子里？这样会不会导致细胞破裂啊？ P：不知道你的这步是不是按照J Sheen方法做的，我们一般100g的低速离心机离心下收集。这样会特别多，我转GFP手气好时，70-80%没有问题。 4. 我们的激光共聚焦是倒置的，我都盖盖玻片了，这个过程不会把细胞压破吧？我在观察的时候会看到有些细胞慢慢的在变形，刚看的时候还是圆的，很完整很漂亮，等到拍照完了叶绿体等都跑到一边去了，这是什么原因造成的呢，有办法解决吗？ P：盖盖玻片轻轻放下是不会压破的；细胞慢慢的在变形，这个与你强光照射有关系，水分蒸发导致溶液浓度加大，细胞甚至会破，所以要保证溶液不会被蒸发。 |
6楼2013-08-27 10:41:53
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十分感谢你的答复啊。 我们实验室之前是没有养拟南芥的，没有专门种拟南芥的房间，现在是种在培养箱里面的。光周期13h11h，温度22度，湿度60%左右。J Sheen说的是弱光，50个单位，我测了一下，在一个培养箱里面比较靠近灯的地方有30-40左右，有点太弱了，拟南芥长得也挺慢，我想可能是光照弱的原因。另一个培养箱可以调光强，但是种了以后也长得不太好，不知道是不是因为光照还是太弱的原因。 还有我觉得我在上共聚焦之前用普通显微镜观察原生质体好像都还可以，但是随着观察时间延长，慢慢就在变形、破裂。可能是你提到的强光照射有关系。因为我之前没有离心，所以一个片子上的原生质体很少，我都在荧光下找，这样是不是也容易造成原生质体的损伤？ 你说你们都是离心以后再去共聚焦观察？是在六孔板里保持12-16h后，用100g离心，去掉上清再观察？我试过一次把六个样品都离心，但是越到后面破损就越多。是不是离心一个观察一个比较好？ |
7楼2013-08-30 16:48:14
~春梦秋云~
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8楼2014-05-08 13:39:46
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9楼2014-06-09 09:55:21
