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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 如何提高拟南芥原生质体转化的效率已有1人参与

最近做拟南芥原生质体转化，用的两个质粒（一个红色荧光，一个绿色荧光）来转化。效率很低，也有很多破裂。想请教各位：
1. 质粒提取的方法是Tape-Arabidopsis Sandwich，但是试剂配制等又有参考了J Sheen方法的。应该差别不大的吧。叶片状态不稳定，这个可能是关键，用的是弱光下的叶片，长得非常慢，起码要6周才能长到J Sheen说的四周大小。不知道这个影响大不大。
2. 转化后是放在光下的，16-24h都试过了，效率都没有很高。到底是在光下好还是黑暗呢，时间多久合适呢？
3. 在激光共聚焦观察之前，转化体系都一直保持在六孔板里面，但是这样去检测的时候浓度就太稀了，找细胞都要找好久，不知道能不能离心一下放管子里？这样会不会导致细胞破裂啊？
4. 我们的激光共聚焦是倒置的，我都盖盖玻片了，这个过程不会把细胞压破吧？我在观察的时候会看到有些细胞慢慢的在变形，刚看的时候还是圆的，很完整很漂亮，等到拍照完了叶绿体等都跑到一边去了，这是什么原因造成的呢，有办法解决吗？

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1楼2013-08-22 16:01:53

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xiemin217

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
七八月的阳光: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-30 16:36:18

根据我的经验，逐条回答如下：
1. 质粒提取的方法是Tape-Arabidopsis Sandwich，但是试剂配制等又有参考了J Sheen方法的。应该差别不大的吧。叶片状态不稳定，这个可能是关键，用的是弱光下的叶片，长得非常慢，起码要6周才能长到J Sheen说的四周大小。不知道这个影响大不大。
P：质粒提取可以考虑去内毒素，这个方法和试剂盒比较多。叶片状态不稳定，这个是原生质体游离，我们有充分经验告诉这个很关键，建议生长在12h12h的环境下，适当遮光，叶片状态尽量接近J Sheen视频上的样子。叶片状态不好，原生质体破碎会严重，叶绿体也会明显靠向一边。
2. 转化后是放在光下的，16-24h都试过了，效率都没有很高。到底是在光下好还是黑暗呢，时间多久合适呢？
P：我们一般过夜暗转化，12-16h，时间长可能未必效率就很高。还有转化效率不高会不会给你使用的质粒有关。
3. 在激光共聚焦观察之前，转化体系都一直保持在六孔板里面，但是这样去检测的时候浓度就太稀了，找细胞都要找好久，不知道能不能离心一下放管子里？这样会不会导致细胞破裂啊？
P：不知道你的这步是不是按照J Sheen方法做的，我们一般100g的低速离心机离心下收集。这样会特别多，我转GFP手气好时，70-80%没有问题。
4. 我们的激光共聚焦是倒置的，我都盖盖玻片了，这个过程不会把细胞压破吧？我在观察的时候会看到有些细胞慢慢的在变形，刚看的时候还是圆的，很完整很漂亮，等到拍照完了叶绿体等都跑到一边去了，这是什么原因造成的呢，有办法解决吗？
P：盖盖玻片轻轻放下是不会压破的；细胞慢慢的在变形，这个与你强光照射有关系，水分蒸发导致溶液浓度加大，细胞甚至会破，所以要保证溶液不会被蒸发。