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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 有人在做BiFC吗？
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鸦米

新虫 (小有名气)

[交流] 有人在做BiFC吗？ 已有16人参与

因为我近期要做BiFC,我们实验室之前没有人做过，所以想请教曾经做过的朋友一些问题，哪位做过可以交流一下吗？
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1楼 2014-06-04 11:54:13
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gyesang

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2楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-04 16:43:30
我在做，有什么问题请详细列出来

我做的A蛋白和B蛋白确定有相互作用，但是用BiFc互补后，荧光很弱，你觉得会有什么可能的原因？
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14楼2014-06-07 11:57:06
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17楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-07 18:17:40
蛋白丰度不够可能是一个原因，另外，我觉得也可以考虑你究竟把荧光蛋白连接在目的蛋白的N端还是C端，这有时候也会影响荧光信号强度...

的确我的蛋白比较大，1700多个aa，荧光强度比较低，我想过可能有两个原因：
1. 荧光蛋白的N和C端，接上目的蛋白，目的蛋白影响了荧光蛋白正确构象的形成，导致互补后荧光强度低

2. 荧光蛋白的N或者C端能够形成正确的构象，但目的蛋白相互作用后，由于空间位置的关系，荧光蛋白的N端和C端，不能很好的靠在一起，彼此接近发出荧光

如果排除上述两种情况的影响
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19楼2014-06-07 19:08:22
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:27:17
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21楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 06:03:46
试试用不同的BIFC载体，分别连在N端或C端试试。对蛋白构象的影响，我感觉荧光蛋白没那么大，不用太担心，很可能影响还是你说的第二条。另外，你用的载体上启动子是什么？...

试试用不同的BIFC载体，什么意思，表达出来的不还是原来的融合蛋白吗，我是在哺乳动物细胞里面做的，用的是CMV启动子
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22楼2014-06-08 11:17:48
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23楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-08 16:16:42
我指的是将荧光蛋白表达在N端或C端的不同载体...

基本8种组合都有试过的，就是不亮，不知道再如何做优化，有一个蛋白1700aa，不知道蛋白是不是有点大了
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24楼2014-06-08 17:54:11
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25楼: Originally posted by starseacow at 2014-06-09 05:13:15
在前面的帖子里看成bp了，如果是1700aa的话，确实很大。我不懂动物方面的研究，是否有更强的启动子之类提高表达水平的办法？...

看了那篇关于BiFc的nature protocol上的文章，外源表达量与内源的表达量相当的话比较好，如果外源的表达量过大的话，会不会产生背景？
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28楼2014-06-09 10:36:12
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