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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌超声破碎问题，欢迎大神前来探讨
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zep616745243

银虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌超声破碎问题，欢迎大神前来探讨 已有4人参与

近期做原核表达，BL21（DE3）菌株，取5ml菌液离心，PBS重悬3次，最后加1mlPBS重悬进行超声破碎，120W，超3s，停10s，冰浴。空载体菌超声2min（即40个循环）即可完全澄清，但离心可见黑色沉淀（一部分是），而超声重组载体菌时 超2min多，菌液还是有些不澄清（和空载体菌相比，浑浊度较大），离心看到较多的黑色沉淀。据说这是超过的结果，那么是不是说我的超声已经完全了？另外我想知道一下，相同超声条件下，若空载体菌破碎完全，那么重组载体菌是否也应该是超声完全的？欢迎大神不吝赐教！
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只有不断地失败才会成功
1楼 2014-05-31 21:43:27
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alfredwing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
zep616745243: 金币+3, ★★★很有帮助, 恩，我再摸索一下条件，谢谢 2014-06-06 19:32:28
菌体量没有太大差异的情况下（可通过测OD确认），重组载体菌沉淀变多，最大的可能是重组蛋白有表达，并且主要是在包涵体中，超声完后离心，分别取上清和沉淀样品跑一下SDS-PAGE看一下就清楚了。
而沉淀发黑，最大可能就是超过了，你的程序参数除功率外没有太大问题，就是循环次数可能略多，5ml菌液不用超那么多次，建议减少循环次数，略微调低功率，冰浴时在冰块中加水，冰水浴效果更好。

此外，只要菌株一样，同样超声程序的效果是一致的。
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7楼2014-06-06 09:04:47
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zangying1989

新虫 (初入文坛)
离心后的黑色沉淀，个人认为是破碎后细胞内的物质，一般破碎不了的离心就不会出现黑色沉淀。混浊的话可以在灯光下观察液体是否透光，透光表明细胞已经破碎，浑浊可能是破的不完全所致。
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8楼2014-06-07 15:06:39
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
对照空载体菌株和你的表达菌株在超声破碎的时候应该是一致的，至于混浊，可能是蛋白的原因
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5楼2014-06-05 05:33:16
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79377

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zep616745243(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-01 13:02:39
zep616745243: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-03 08:44:18
黑色沉淀据说是超声破碎仪的探头上脱落的铁屑，肯定是破碎完全了，有时候破碎后很混浊有可能是你的目的蛋白表达了且无法溶于你的缓冲体系中所致

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2楼2014-06-01 07:38:59
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 79377 at 2014-06-01 07:38:59
黑色沉淀据说是超声破碎仪的探头上脱落的铁屑，肯定是破碎完全了，有时候破碎后很混浊有可能是你的目的蛋白表达了且无法溶于你的缓冲体系中所致

应该不是铁屑吧，探头应该都是不锈钢的，我用的是PBS缓冲液去超声的，不知道是不是这个原因
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3楼2014-06-03 08:46:19
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79377

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
zep616745243: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-06 19:32:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-06-03 08:46:19
应该不是铁屑吧，探头应该都是不锈钢的，我用的是PBS缓冲液去超声的，不知道是不是这个原因...

举个例子吧，如果你表达的目的蛋白表达量很高或者对大肠自身有一定毒性进而形成了包涵体的话，你破碎细胞后就会很混浊，或者你的目的蛋白由于自身的性质而无法溶于PBS.也会出现你说的情况

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4楼2014-06-04 22:29:18
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫

【答案】应助回帖

★
zep616745243: 金币+1, ★有帮助 2014-06-06 19:34:00
黑色 沉淀是超声功率过大啊，你注意控制下功率
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
6楼2014-06-05 10:52:06
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zangying1989 at 2014-06-07 15:06:39
离心后的黑色沉淀，个人认为是破碎后细胞内的物质，一般破碎不了的离心就不会出现黑色沉淀。混浊的话可以在灯光下观察液体是否透光，透光表明细胞已经破碎，浑浊可能是破的不完全所致。

恩，超声后液体是可以透光的，应该是完全了，甚至过了，条件还要再摸一下，谢谢
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只有不断地失败才会成功
9楼2014-06-09 11:02:47
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
zep616745243: 金币+1, ★有帮助 2014-06-09 12:33:03
100W 10S/10S可以试一试
你的120w太大了
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修身、齐家、治国、平天下
10楼2014-06-09 12:01:23
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