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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

[求助] 用大肠杆菌BL21养蛋白时菌体总是结成块状怎么办!!! 已有3人参与

用BL21养一个内源蛋白,之前用LB养的时候OD正常,只是表达量不高,还是可以纯化出来;但是现在改用M9养,怎么也摇不起来,菌体都在瓶底结成团,上清很澄清,结成的菌块使劲摇可以摇散。用的M9培养基pH7.0,尝试过增大摇床转速到270~300rpm和用大瓶子摇少量菌液,都没有解决问题,确定不是噬菌体污染,同批的表达其他蛋白的菌很正常~小女纸求各位大神指点!!!
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励交流! 2014-02-26 09:23:24
应该是培养的条件不太合适吧,有没有在瓶子中加入玻璃珠?
表达蛋白是碱性蛋白么?如果是就比较难处理
2楼2014-02-25 20:48:41
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dllchina at 2014-02-25 20:48:41
应该是培养的条件不太合适吧,有没有在瓶子中加入玻璃珠?
表达蛋白是碱性蛋白么?如果是就比较难处理

表达的蛋白等电点7.4,我的培养基pH7.0,不是碱性啊~另外养大肠杆菌也可以加玻璃珠么?怎么加呢?
3楼2014-02-26 09:42:59
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hq0250

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蝶影拂袖: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢你的帮助~! 2014-02-27 15:27:26
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-26 09:42:59
表达的蛋白等电点7.4,我的培养基pH7.0,不是碱性啊~另外养大肠杆菌也可以加玻璃珠么?怎么加呢?...

培养基带着玻璃珠一起消毒即可。或者选择有挡板的三角瓶摇瓶使用哈
4楼2014-02-26 15:28:51
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by hq0250 at 2014-02-26 15:28:51
培养基带着玻璃珠一起消毒即可。或者选择有挡板的三角瓶摇瓶使用哈...

好奇怪,出问题的三个蛋白中有两个又正常了,可能是用LB养种子液的时候加入了葡萄糖的缘故吧(我的M9碳源是葡萄糖)~另一个还是没长,再试最后一次!今天接到带挡板的瓶子里了,刚诱导,期待有效果~
5楼2014-02-27 15:01:43
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

菌液在第一步扩大培养时可以加葡萄糖,但是大批量用的时候不要加葡萄糖了。
6楼2014-02-27 17:12:30
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-02-27 17:12:30
菌液在第一步扩大培养时可以加葡萄糖,但是大批量用的时候不要加葡萄糖了。

没懂...我的M9培养基是以葡萄糖做碳源的呀
7楼2014-02-28 09:00:48
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-28 09:00:48
没懂...我的M9培养基是以葡萄糖做碳源的呀...

你的培养基在加IPTG诱导的时候加葡萄糖吗?
8楼2014-02-28 09:11:38
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-02-28 09:11:38
你的培养基在加IPTG诱导的时候加葡萄糖吗?...

养种子液的时候我是用的LB+0.4%的葡萄糖(目的是转接到M9后葡萄糖是碳源,让菌早早适应);M9是以0.4%的葡萄糖作碳源的,之前就加好了,IPTG诱导的时候不加葡萄糖的
9楼2014-02-28 10:04:42
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-27 15:01:43
好奇怪,出问题的三个蛋白中有两个又正常了,可能是用LB养种子液的时候加入了葡萄糖的缘故吧(我的M9碳源是葡萄糖)~另一个还是没长,再试最后一次!今天接到带挡板的瓶子里了,刚诱导,期待有效果~...

悲剧啊!原本以为养起来了,结果诱导后菌基本就不长了,离心收菌后准备重悬超声,结果发现静置一会儿就沉下来了!!!什么情况!!!!求解??!
10楼2014-03-05 14:18:06
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