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尹框笔记

木虫 (小有名气)

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[求助] 有关PMSF和蛋白酶抑制剂的一些问题已有3人参与

求教！
1、我在提取胞外蛋白的时候，用的是醋酸缓冲液，其中含有1mM的PMSF和商品化的蛋白酶抑制剂，可是PMSF的作用不就是抑制蛋白水解酶的活性吗？为什么两个都要添加呢？
2、我称了1mM的PMSF添加到醋酸缓冲液中，可是PMSF基本就只是飘浮在表面，好长时间都不溶解，这是为什么呢？我也看到网上说用乙醇或异丙酮溶解，那我是直接向缓冲液中添加1mM PMSF吗？还是添加用乙醇或异丙酮溶解了的PMSF？
3、我看一些文献上提取胞外蛋白的时候只用蛋白酶抑制剂就好了，不用额外添加PMSF。但是蛋白酶抑制剂组分里面就含有PMSF，这是不是表明我用含有PMSF的蛋白酶抑制剂，就不用额外添加PMSF了？
求教各位大神，若有完美解答，不甚感激！

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1楼2014-03-25 15:40:57

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gyesang

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【答案】应助回帖

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尹框笔记: 金币+16, ★★★很有帮助, 谢谢解答，很有帮助！ 2014-03-26 08:32:29

1. 体内蛋白酶根据作用机制和活性位点分很多种，丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶等，各蛋白酶抑制剂有些是光谱的，可以抑制大部分种类的蛋白酶，有些不是光谱的可能只抑制一两种蛋白酶，比如PMSF就只抑制丝氨酸蛋白酶，这就是为什么在蛋白提取时要加入蛋白酶抑制的cocktail而不是单独的一两种

2. PMSF难溶于水，要预先配置成母液，用无水乙醇配成100mM的stock，-20度保存，用时按1：100加即可

3. 大部分时候蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF一起加比较好，实际上正如你所说，cocktail里面已经有丝氨酸蛋白酶抑制剂了，可以不必加PMSF

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2楼2014-03-25 16:02:35

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biostar2009

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

PMSF，苯甲酰磺酰氟，应该是最便宜的蛋白酶抑制剂，小分子，能够抑制丝氨酸蛋白酶，能够进入丝氨酸蛋白酶催化中心，并与催化中心的丝氨酸反应，将丝氨酸的羟基取代，生成苯甲酰磺酰丝氨酸和HF，因此也有报道PMSF即便水解之后也很有毒性。
PMSF的抑制剂，毒性作用都来自与其易水解的特性，因此PMSF的水溶液半衰期都特别短，所以PMSF都是在有机试剂，乙醇，异丙醇，DMSO中溶解的。需要注意的是，在这些介质中溶解后并不需要低温保存，没有必要，这些环境中PMSF在室温就是稳定的。具体文献忘记了。。。
相反，如果放在低温环境中，PMSF极易析出，成冰针状颗粒，而且个人经验，一旦析出，即便放到水里面也不会溶解，至少在实验过程的那几个小时中。

蛋白酶抑制剂有很多种，PMSF是最出名的特异性有机小分子抑制剂，剩下的都是一些蛋白性质的蛋白酶抑制剂，PMSF只能失活丝氨酸蛋白酶，虽然丝氨酸蛋白酶家族是最大的蛋白酶家族，但肯定还有其他。所以现在商品化的蛋白酶抑制剂cocktail就是这个卖点。里面混有很多可以抑制其他蛋白酶的蛋白类抑制剂，因为是蛋白类的，所以价格显然比PMSF贵很多。

所以，PMSF只是抑制了最主要的蛋白酶，而cocktail可以比较全面的抑制蛋白酶，也正如楼主所说，那些cocktail中一般也添加有PMSF。

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3楼2014-03-25 16:12:49

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